BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐẶNG XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PHLOROTANNIN TỪ
RONG MƠ (SARGASSUM
SERRATUM
) TẠI NHA
TRANG VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỒ
UỐNG CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 62540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Trường Đại học Nha Trang hoặc thư viện Quốc gia Hà Nội.

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Rong nâu (Phaeophyta) là loại rong giàu các chất có hoạt tính sinh
học như lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất này
có nhiều hoạt tính sinh học, trong đó đáng chú ý là hoạt tính chống
oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…. Ngành rong nâu (Phaeophyta)
có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae và Sargassaceae.
Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ
(Sargassaceae) được biết là chi rong có sản lượng lớn và có giá trị
cao, do chi rong này có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như
fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,…. Trong đó đáng chú ý là
phlorotannin - một hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp
phenolic. Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như:
hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u,
ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin là một
trong những hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất và phlorotannin
được biết đến là chất chống oxy hóa không độc và an toàn với con
người nên có thể khai thác và sử dụng trong hỗ trợ cơ thể đào thải các
gốc tự do giúp tăng cường sức khỏe. Do vậy, phlorotannin từ rong mơ
đã được các nhà nghiên cứu quan tâm.
Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú và
đa dạng về số lượng, chủng loại. Mặt khác, rong mơ ở vùng biển Nha
Trang được cho rằng có chứa các hoạt chất sinh học như fucoidan,
phlorotannin, alginate,…. với hàm lượng cao. Do vậy việc nghiên cứu

4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chuẩn của Thế giới
và Việt Nam trong nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ
(Sargassum serratum), có sử dụng toán học để tối ưu hóa nhằm tìm ra

3
các quy luật, phát hiện ra các tính chất mới, các mối quan hệ giữa các
đại lượng và kiểm chứng các giả thuyết.
5. Các đóng góp mới về mặt khoa học
- Lần đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về phlorotannin của
rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang,
Khánh Hòa từ nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết đến tinh sạch,
thử nghiệm độc tính trên chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế
phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và thử nghiệm sản
xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy, kết quả
nghiên cứu của Luận án có ý nghĩa khoa học cao. Kết quả này góp phần
khẳng định giá trị của nguồn lợi rong biển Việt Nam. Mặt khác, kết quả
của luận án còn là tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng
dạy trong lĩnh vực nghiên cứu các chất tự nhiên từ rong biển
.
- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở để các doanh nghiệp sản
xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa một số sản phẩm từ
phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở
vùng biển Nha Trang.
6. Kết cấu của luận án
Luận án bao gồm 171 trang, trong đó 34 trang tổng quan, 22 trang
phương pháp nghiên cứu, 89 trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2
trang, tài liệu tham khảo 24 trang và phụ lục.

5
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN
TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
* Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hỗn hợp phenolic trong rong nâu
chính là phlorotannin (Jormalainen và cộng sự, (2004); Koivikko và
cộng sự, (2007); Swanson và cộng sự, (2002)). Siti A. Budhiyanti và
cộng sự (2012) công bố khả năng bắt gốc tự do (DPPH) dao động từ
14,61 ÷ 48,71% và 0,17 ÷ 44,05% tương ứng khi dịch chiết từ thành tế
bào và tế bào chất có nồng độ 0,45 mg/ml; hoạt tính khử sắt dao động
từ 2,05 ÷ 12,51% và 26,77 ÷ 68,80% tương ứng khi dịch chiết từ tế
bào chất và thành tế bào của một số loài Sargassum thu ở bờ biển
Indonesia có nồng độ 0,45 mg/ml được sử dụng, các dịch chiết này
đều chứa phlorotannin. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của loài S.
ramifolium và S. pteropleuron với chỉ số oxi hóa EC50 dao động từ
6,64 đến 7,14 mg/ml (Mayalen Zubia và cộng sự, 2007). Đồng thời
Soo Jin Heo và cộng sự (2005) chỉ ra khả năng bắt gốc tự do của loài
S. thunbergii và S. fulvellum tương ứng là 97,41% và 84,66%. Hoạt
tính chống oxy hóa mạnh của phlorotannin tinh chế từ một số loài
rong nâu có mối liên hệ mật thiết với phân tử skeleton (Ahn và cộng
sự, 2007). Như vậy thấy rằng có sự đa dạng về hoạt tính và hoạt lực
của phlorotannin ở các loài rong Sargassum khác nhau trên thế giới.
Những nghiên cứu trên cùng công bố của Barry Halliwell (2001) đã
cho thấy, phlorotannin có khả năng giảm thiểu sự tổn thương tế bào
dưới tác động của những gốc tự do như: superoxide, hydroxyl,
peroxyl, alkoxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được
coi là gốc tự do. Điều này cũng được minh chứng trên loài S.
ringgoldianum có khả năng bắt gốc (
.

sàng lọc đánh giá hàm lượng trữ lượng theo mùa vụ thời gian sinh
trưởng cũng như sự tích lũy và phân bố ở từng phần cây rong hay
theo thời gian bảo quản. Do vậy Luận án tập trung nghiên cứu những
vấn đề trên.

7
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Rong mơ (Sargassum serratum) thuộc: Ngành (Phaeophyta),
Lớp (Phaeophyceae), Bộ (Fucales), Họ (Sargassaceae),
Chi (Sargassum).
Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng ở vùng biển Nha
Trang - Khánh Hòa được thu mẫu, rửa sạch bằng nước mặn, sấy khô
đến độ ẩm 19% và bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá
trình nghiên cứu.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp phân tích
2.2.1.1. Phƣơng pháp định lƣợng phlorotannin: theo Swanson
và cộng sự, 2002, với phloroglucinol là chất chuẩn.
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
+ Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): theo phương pháp của
Prieto và cộng sự, (1999) với chất chuẩn là acid ascorbic.
+ Hoạt tính khử Fe (RP): xác định theo Zhu và cộng sự, (2002)
với chất chuẩn là FeSO
4
.
+ Hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH): xác định hoạt tính bắt gốc tự
do (DPPH) theo Blois M. S. (1958)
Sử dụng máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/6405 để
đo độ hấp thụ.

là HPLC-MS, nhận biết chất qua tỉ lệ m/z.
- Chạy LC/MS: Chương trình gradient như sau:
Bảng 2.1. Chƣơng trình gradient trên LC/MS Thời gian
Pha B (%)
0
10
10
10
40
90
60
90
61
10
70
10

9

2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho
điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 với thang điểm 20 để đánh
giá chất lượng cảm quan của sản phẩm.
2.2.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ ml) theo TCVN
4884:2005.
- Xác định E. coli theo TCVN 6848:2007.
- Xác định Coliforms theo TCVN 6846:2007.

2.3.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng
Sử dụng các thiết bị chủ yếu hiện có trong các phòng thí nghiệm
Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
- Trung tâm Thực hành phân tích - Trường Đại học Nha Trang gồm:
Thiết bị ổn nhiệt - Memment (Đức), máy đo pH HANA (Mỹ), Thiết bị
Cô quay chân không (Đức), Máy sấy phun Bucchi - Thụy Sỹ, máy so
mầu UV- VIS - Mỹ,…
2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Phân tích dữ liệu và tiên đoán bề mặt đáp ứng bằng phần mềm
Design Expert 8 trial, Nemrodw và Excell. Nghiệm thức được lặp lại 3
lần. Giá trị bất thường được loại bỏ bằng phương pháp Dulcan. 12
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ
RONG MƠ S. SERRATUM
3.1.1. Xác định dung môi chiết rút phlorotannin
Kết quả cho thấy dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng
phlorotannin (Phc) và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết. Đối
với cả 2 phương pháp chiết (hồi lưu và ngâm chiết) thì hàm lượng Phc
và hoạt tính chống oxy hóa thu được đều giảm dần theo thứ tự dung
môi chiết như sau: ethanol > acetone > ethyl acetate > chloroform > n-
hexan.

Kết quả phân tích cũng cho thấy chiết rút phlorotannin từ rong

acid ascorbic/g DW và 24,228 ± 0,014 mg FeSO
4
/g DW. Trong khi đó
nếu chiết với tỷ lệ dung môi (DM): nguyên liệu (NL) 10:1 (v/w) thì
hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP của dịch chiết chỉ đạt tương ứng
57,80%, 73,63%, 86,50% so với khi chiết với tỷ lệ DM:NL 40:1
(v/w). Nếu chiết với tỷ lệ DM/NL 30:1 (v/w) thì Phc, TA và RP của
dịch chiết chỉ đạt 86,57%, 96,79%, 86,89% so với khi chiết ở tỷ lệ
DM:NL 40:1 (v/w). Nếu chiết tỷ lệ DM/NL 50/1 (v/w) hàm lượng
phlorotannin (Plc), hoạt tính oxy hóa tổng (TA), hoạt tính khử sắt
(RP) của dịch chiết đạt 96,32%, 96,61%, 96,65% so với khi chiết ở tỷ
lệ DM:NL 40:1 (v/w). Do vậy, tỷ lệ giữa dung môi chiết so với
nguyên liệu rong là 40:1 (v/w) được lựa chọn để nghiên cứu chiết rút
phlorotannin từ rong mơ S. serratum.
3.1.4. Xác định nhiệt độ chiết
Kết quả phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy khi chiết rút
phlorotannin từ rong mơ (S. serratum) ở 50
0
C thì dịch chiết thu được
có hàm lương phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt
tính khử sắt cao nhất. Do vậy, nhiệt độ được lựa chọn cho quá trình
chiết phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum
serratum là 50
0
C.
3.1.5. Xác định thời gian chiết
Kết quả phân tích cho thấy sự thay đổi hàm lượng Phc theo thời
gian chiết tuân theo phương trình phi tuyến bậc 2, kết quả này cũng
tương đồng với nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S.
mcclurei của Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội,

Kết quả phân tích cho thấy pH 7 phù hợp với quá trình chiết rút
phlorotannin từ rong mơ S. serratum. Do vậy, chúng tôi lựa chọn pH
của dung môi để chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum là 7.
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép lựa chọn một số thông số phù
hợp cho quá trình chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ
rong mơ Sargassum serratum làm cơ sở cho việc tối ưu hoá quá trình
chiết rút sau này như sau: Nhiệt độ: 50
0
C, thời gian chiết 32 giờ, dung
môi chiết là ethanol 96%, tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu (DM:NL)
là 40:1 (v/w).

15
3.2. TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT
PHLOROTANNIN THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-BEHNKEN
Sau khi xác định được một số điều kiện phù hợp để chiết
phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ S. serratum.
Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá trình chiết rút phlorotannin từ rong
mơ S. serratum các biến số như sau: Nhiệt độ chiết (U
1
: 24 - 60
0
C),
thời gian chiết (U
2
: 16 - 42 giờ) và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
(U
3
: 10 - 50). Các hàm mục tiêu Y
1

3

Y
1

Y
2

Y
3

24
16
30
-1
-1
0
1,607
1,652
1,575
60
16
30
1
-1
0
1,292
3,640
6,650
24

0
-1
1,670
4,970
10,325
24
29
50
-1
0
1
0,914
1,246
6,020
60
29
50
1
0
1
2,394
6,300
11,830
42
16
10
0
-1
-1
2,079

18,410
42
29
30
0
0
0
6,017
15,400
45,150
42
29
30
0
0
0
6,080
15,442
45,080
42
29
30
0
0
0
6,048
15,414
45,010
Y
1

Y
2

Y
3

DPPH
tb

43
33
27:1
5,92
15,06
45,27
61,55
43
33
27:1
5,98
15,11
45,34
64,66
43
33
27:1
5,96

80,32
82,11
43
33
27:1
33,70
57,40
69,90
79,70
82,59
43
33
27:1
36,00
59,80
70,23
81,40
81,30
Ghi chú: DPPHtb: hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH) trung bình

17
Kết quả tối ưu hóa này phù hợp với dữ liệu thực nghiệm đã kiểm
định về quá trình chiết phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ
Sargassum serratum. Từ kết quả này cho phép chọn điều kiện chiết tối
ưu cho quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum: dung
môi chiết là ethanol 96%, nhiệt độ chiết tối ưu 43
0
C, tỷ lệ dung môi so
với nguyên liệu (DM:NL) 27:1 (v/w) và thời gian chiết 33 giờ
* Xác định số lần chiết

để cô đặc dịch phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ.
3.4. NGHIÊN CỨU TINH CHẾ PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT
TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADEX LH 20
3.4.1. Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel Sephadex LH 20
Tiến hành tách phân đoạn dịch phlorotannin cô đặc lần lượt bằng
các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Phân
đoạn sạch nhất được chạy qua cột sephadex LH 20, cột 2x25cm, mỗi
phân đoạn thu 10ml. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và 3.3.

Hình 3.2. Hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
của các phân đoạn dịch cô đặc bằng các dung môi khác nhau

Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch phlorotannin từ rong mơ S. serratum cô đặc qua cột lọc
gel Sephadex LH 20, cột 2x25cm, 10ml/phân đoạn

19
Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch phlorotannin
ST
T
Giai đoạn
tinh chế
Hàm lƣợng
phlorotannin
(g
phloroglucinol/g
DW)
Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính bắt
gốc tự do
DPPH (%)

Phân đoạn bằng dung môi hữu cơ
1
N-hexan
0,2980 ± 0,0032
68,52 ± 0,08
0,3063 ± 0,0017
1,2499 ± 0,0026
2
Chloroform
0,2060 ± 0,0011
70,84 ± 0,16
0,4785 ± 0,0036
2,0169 ± 0,0030
3
Ethyl acetate
0,8179 ± 0,0025
86,53 ± 0,21
2,1444 ± 0,0010
10,5862±0,0016
4
n-butanol
0,5194 ± 0,0030
80,61 ± 0,17
0,5743 ± 0,0026
2,8197 ± 0,0018
5
Dịch trong
nước còn lại
0,1748 ± 0,0050
76,55 ± 0,23

Hình 3.4. Dịch chiết
ethanol trên sắc ký bản
mỏng trƣớc khi phun
thuốc thử
Hình 3.5. Dịch chiết ethanol
trên sắc ký bản mỏng sau
khi phun thuốc thử
Hình 3.6. Phân đoạn
ethyl acetate trên sắc ký
bản mỏng sau khi phun
thuốc thử Hình 3.7. LC/MS của dịch chiết
ethanol ban đầu
Hình 3.8. LC/MS của phân đoạn
n-hexan

21 Hình 3.9. LC/MS của phân đoạn
chloroform
Hình 3.10. LC/MS của phân đoạn
ethyl acetate
Hình 3.11. LC/MS của phân đoạn
n-butanol

Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong S.
serratum
Nguyên liệu
rong mơ
Chiết
Thời gian: 33 giờ
Nhiệt độ: 43
0
C
Tỷ lệ DM:NL: 27:1 (v/w)
Lọc
Phân đoạn
chloroform

Phân đoạn
EtOAC

Phân đoạn n-
butanol

Phân đoạn lần
1
Cô đặc


chiết ở nhiệt độ 43
0
C, trong 33 giờ với tỷ lệ DM:NL 27:1 (v/w).
+ Lọc
Dịch chiết được lọc qua giấy lọc để thu dịch lọc. Dịch lọc
phlorotannin được bảo quản trong chai sẫm màu nhằm hạn chế tác
động của ánh sáng làm hư hỏng phlorotannin.
+ Cô đặc
Dịch lọc được cô đặc ở nhiệt độ 40
0
C để thu cao chiết. Sau khi cô
đặc, cao chiết được tái hòa tan bằng ethanol 99,5% và loại bỏ phần
cặn không tan trong ethanol 99,5%. Dịch tái hoà tan thu được, tiếp tục
được tái cô đặc còn lại một phần ba thể tích và bảo quản trong chai
sẫm màu. Phần dịch này sẽ được phân đoạn làm sạch bằng các dung
môi hữu cơ từ không phân cực tới phân cực mạnh ở công đoạn tiếp
theo.
+ Phân đoạn lần 1
Dịch sau khi cô đặc được tách phân đoạn bằng n-hexan để thu phân đoạn
tan trong n-hexan và tách phân đoạn trong n-hexan bảo quản trong chai sẫm
màu
.
+ Phân đoạn lần 2
Dịch còn lại sau khi tách phân đoạn n-hexan được tiếp tục tách
phân đoạn bằng chloroform để thu phân đoạn tan trong chloroform và
tách riêng phân đoạn trong chloroform bảo quản trong chai sẫm màu.
+ Phân đoạn lần 3