I HC C
KHOA THU SN

NGUYN NG PHÁT
KHO SÁT KH  VI KHUN LACTIC KHÁNG
VI KHUN Edwardsiella ictaluri GÂY BNH GAN THN
M TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUT NGHII HC
NGÀNH BNH HC THU SN

2013 i

I HC C
KHOA THU SN

 tài này.
Quí Thy, Cô và cán b Khoa Thy si hc Co mi
u kin thun li cho tôi hoàn thành lu
Tôi chân thành c ch dn ht sc nhit tình ca ch  Th Kim
Loan lp cao hc K18.
Cn bo Trung, các bn Trng Phm Hòa
Hip và tp th lp bnh hc thy s tôi, luôn bên tôi khi tôi gp

C
Sinh viên thc hin Nguyng Phát iii

TÓM TT
 tài kho sát kh n lactic kháng vi khun Edwardsiella
ictaluri gây bnh gan thn m trên cá tra, nhm tìm ra mt s chng vi khun
lactic có kh i kháng vi khun E. ictaluri. Ngun vt li phân lp
vi khun lactic trong thí nghii mui chua và rut cá rô phi
c thu mua  các ch a bàn Thành ph C, vi khuc
phân lp bng MRS agar và MRS broth. Các dòng vi khuc
chn lc da trên kh i CaCO
3
c thêm vàng MRS
agar và có các ch tiêu sinh hóa 
tính s c chn phân lp. Kt qu là 34 chng vi khuc phân
lp và c kho sát tính kháng vi vi khun E. ictaluri b

2.2 Vi khun lactic (LAB: Lactic acid bacteria) 4
2.2.1 Gii thiu v vi khun lactic 4
2.2.2 Khái quát v phân loi 5
2.2.3 Vi khun lactic trong quá trình lên men 6
2.2.4 Kh n ca vi khun lactic 7
2.3 Mt s nghiên cu v vi khung vt thu sn 8
nh danh vi khun lactic bc phân t 9
 11
VT LIM 11
3.1 Thm 11
3.2 Vt liu thí nghim 11
3.3 u 11
p vi khun lactic t ru
ci mui chua 11
 n E. ictaluri ca các
dòng vi khun lactic 12
3.3.3 nh danh vi khun 13
Trang v

 14
KT QU VÀ THO LUN 14
4.1 Kt qu quá trình phân lp vi khun lactic 14
4.2 Kt qu kho sát kh i kháng vi khun Edwardsiella ictaluri
bng khuch tán (Well diffusion agar) 16
4.3 Kt qu nh danh bi trình t gen 21
 22
KT LU XUT 22
vii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Kh n ca mt s chng vi khun lactic 9
Hình 4.1 Quá trình phân lp và tách ròng vi khun lactic:
A, B: Phân lp vi khun lactic
n. 14
Hình 4.2 Kh i CaCO
3
ca vi khun lactic (A), mu nhum
Gram tiêu biu (B) 15
Hình 4.3 Kt qu ng khuch tán nghim thc 1 18
Hình 4.4 Kt qu ng khuch tán nghim thc 2 20
Hình 4.5 Các mi chng 20
Hình 7.1 Mt s nh kt qu ng khuch tán 32
Trang viii



LAB Lactic Acid Bacteria
RP Rô phi
DC i
E. ictaluri Edwardsiella ictaluri
AMC Amoxicillin-clavulanic acid

N l cht là cao nht (60 - 80%) (Crumlish et al., 2002).
T l hao ht cao nht  n cá git hi nng nht 
n cá la c 300-500g (T Thanh Dung và ctv., 2005).
Do yêu cu thc tin sn xui nuôi phng thâm canh
ng thi s dng nhiu thuc kháng sinh. Tuy nhiên, do vic chn và s
dng          nhy ca vi khun
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp. i vi các loi thuc kháng sinh ngày
càng giu tr n gn (Nguyc Hin,
2008. Trícn bi Nguyn Ngc Trai, 2012). Theo
nghiên cu ca Nguyn Thin Nam và ctv. (2010), nghiên cu tìm thy 97,5%
chng vi khun Edwarsiella ictaluri có hic (t ba loi
kháng sinh tr c bi chng kháng t 6-10 loi kháng sinh
chim t l khá cao 25% s chng kháng vi 8 loi thuc kháng sinh, 20% s
chng kháng 9 loi thuc kháng sinh và 10% s chng kháng 10 loi thuc
kháng sinh.
Chính t nhng nguyên nhân trên mà vic tìm ra nhng gii pháp hn
ch vic s dng thuc kháng sinh hi bo v ngun thuc kháng sinh
d phòng là mt nhim v vô cùng cp bách và cn thit ca nhng nhà khoa
hc thu sn. Hin nay vic nghiên cu s dng các ch phm sinh hc
bit là probiotics, bacteriocin  phòng và tr bng vt thu s
c nhiu nhà khoa hc nghiên cu (Nguyn Ngc
Trai, 2012). T lâu vi khun lactic mt nhóm vi khun hc con
i áp dng mt s  , chng cho thc 2

phm. ch bin nhiu loi thc ph      
Thi gian gmt s ng dng nhóm vi khun hu ích này
c thu sn  phòng tr bn hình là vic nghiên cu

cá tra
Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri là loài thuc h Enterobacteriaceace, vi khun
Gram âm, c bii (0,75-ng
hong yu, lên men, cho phn 
tính, phn ng indole và H
2
S âm tính. Vi khun E ictaluri phát trin tt 
28
0
C sau 24-48 gi to thành nhng khun lc nh, tròn có màu
trng, không nhân, rìa và có dng nht (T Thanh Dung và ctv.,
2004).
Edwardsiella ictaluri phát trin t   ng chn lc
Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (pH=7,0-7,2) sau 48 gi  nhi 28-
30°C. Khun lc có dng nh li ti, không trong suc 0,5-1,0 mm
(Shotts et al., 1990). Ngoài ra, khi phân lp vi khun Edwardsiella ictaluri
gây bnh trên cá tra  Vit Nam bng TSA sau 48 gi  28°C cho
thy khun lc có dng pinpoint (nh li ti) có rìa xung quanh, màu trng nht,
c t 0,11-0,17 mm (Crumlish et al., 2002).
Theo Plump (1999), vi khun này tn ti trong môc thi
gian ngn hay dài còn tu thuc vào nhi c, nu nhit 
cc là 5
o
C thì vi khun có th tn t 
lên 25
o
C thì thi gian sng ca vi khun này khong 10 ngày. Mt khác, trong
l nhi 5
o

Theo Ferguson (2001), du hiu bnh lý  n mi chm bnh cá
gim t s ng hp cá biu hi , da nht nht, có
biu hin xut huyt trên da và hu môn. Du hiu bc thù nht là các
ni quan gan thn t tng xut hin nh m trng vng kính t 1-
3mm biu hi thn. Theo T Thanh
Dung và ctv.(2003) thì bm trng có th xy ra  tt c n phát
trin cng nht là  gin 300-500 g vi nhng du hiu
. Tuy nhiên, cn chú ý là  u ca bnh nhm trng
ch xut hin trên thn hoc t tng ca cá (T Thanh Dung và ctv., 2005).
2.2 Vi lactic ( LAB: Lactic acid bacteria)
2.2.1 
Vi khun lactic là nhóm vi khun Gram (+) (Fooks et al., 1999. 
bi Shea Beasley, 2004) lên men hidrat cacbon khi có hoc không có oxy
và to nên sn phm chính cui cùng là axcid lactic (Jay, 2000). Hu h
u hô hp k khí tùy tin hoc vi hiu khí (Endang, 2010). LAB là nhng
vi khun hình cu hoc hình que thc tìm thy trong s phân hu thc
vt, các sn phm lactic, sn xut phn ca quá trình
i cht ca chúng và là sn phm cc tính này
gn bó vi lch s ca các th, vì s acid hoá còn là nhân t km
hm s phát trin ca các nhân t gây hng.
(theo
c bit LAB có nhu cu ch ng phc tp, không có kh
phát tring thun khit cha khoáng, glucoza và NH
4
+
. 
s vi khun lactic cn các vitamin nhóm B, biotin, axit folic, axit nicotinic và
các acid amin khác. Trong t nhiên vi khun lactic sng hoi sinh, chúng s
d  ng thc vt. Nhi  thích
hp cho vi khun lactic t 10 - 40

ng hình (sn phm lên men ch thun axít lactic) và nhóm lên men lactic d
hình (sn phm lên men ngoài axít lactic còn có êtanol, CO
2
hoc axít axêtic).
ng hình bao gm ba nhóm: cu khun (Streptococcus lactic, S.faecalis,
Pediococcus cerevisia), trc khut (Lactobacillus lactic, L. helvetcus,
L. bulgaricus), trc khu  m (Lactobacillus casei, L. plantarum)
(Fugelsang and Edwards, 2007; Caplice and Fitzgerald, 1999; Jay, 2000;
Kuipers et al., 2000). Vi khun lactic lên men d hình (heterofermentaires): s
dng bng pentose phosphate to sn phm cui cùng không
ch acid lactic mà còn các sn ph
2
, ethanol, axit acetic Các
i din cho nhóm vi khun lactic lên men ng hình Leuconostoc,
Oenococcus, Weissella, và lactobacilli nhóm III (L. brevis, L. buchneri, L.
fermentum, L. reuteri) ( . 6

2.2.3 Vi 
Theo Nguyt (2001), vic s dng vi khu mui
chua rau, qu,  chua thc bo qun thc phm bng
công ngh lên men vi sinh vt. Các vi khun lên men lactic ch yu thuc các
ging: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus. Khi mui rau
qu lên men lactic, s to ra sn pht yêu cu sau: (1) Tng
sinh khi vi khun có ích, át ch các vi sinh vt gây thi. (2) Gây chua, to
 n phm. (3) Chuyn rau qu v dng chín sinh hc
du sun hóa sinh hc trong mui
chua rau qu gm n:

s gây hing vc, b y
u kin bt li cho s phát trin ca ni thun li cho vi
khung c u kém cht
ng, vi khung thy  Lactobacillus manitopocrum. 7

Theo Ringø et al. (1998), vi khun lactic thuc các ging 
Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, và Carnobacterium thuc h vi
sinh vng trong rut cá khe. Và m ca vi khun lactic liên
ng tiêu hóa b ng bi yu t ng
   mn. Tuy
nhiên, mt s chng cng vt thy sch
bp k qua  các trang tri Nht
Bn nuôi cá hi vân (rainbow trout)      
(yellowtail) (Kusuda et al., 1976). Các tác nhân gây bc xác
nh là Streptococcus sp.    c phân loi li là Enterococcus
(Kusuda, 1992), tip theo là Lactococcus garvieae (Domenech et al., 1993;
Eldar et al., 1996). Ngày nay, s xut hin bnh trong nuôi trng thy sn
   n rng có th do các vi khun khác nhau thuc các
ging ca vi khu   Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và
Carnobacterium.
2.2.4  vi 
i cht vi khun lactic sinh các sn phm có tác
dng c ch s ng ca các vi sinh vt có h
.
(theo:
Theo Ngô Th  và ctv (2011), kt qu nghiên cu nhng
y vi khun lactic không ch có th lên men rau qu mà

u ra mt loi môi
ng nhân t nghiên cu LAB mang tên MRS theo tên ca 3 tác gi này.

Brachionus plicutilisLactobacillus plantarum
Carnobacteriurn sp  
(Scophthalmus maximus)
Vibrio  ngày
th 9. Và n  t  a vi khun lactic khi giàu hóa là 10
7
- 2 x 10
7

CFU/ml/ngày, t l sng ca u trùng là 53% sau 72 gi tip xúc vi mm
bnh so vi chng t l sng ch u này cho thy vi khu
 kháng ca ng li mm bnh vibrio.
Mt s chng vi khun Lactobacillus sp. c phân lp t rut và
d dày ca cá tra và cá rô phi có kh c ch c vi khun E. ictaluri và
Aeromonas hydrophila gây bnh trên cá tra. Tuy nhiên ch có mt chng Lb12
to ra bacteriocin có kh c ch c 2 loài vi khun gây bnh trên. Kt qu
gii trình t n gen 16S rRNA cho th  ng hình 100% vi
Lactobacillus suntoryeus LH5 (Nguyn Ngc Trai, 2011). Nghiên c
v kh    n gây bnh ca chng vi khun lactic CC4K và
chng vi khun Bacillus sp c phân lp t c
 ci bc ký bn mng và ph hng ngoi cho thy cht
kháng khun do chng CC4K tit ra là axit lactic, còn chng HY1 có kh 
kháng vi sinh vt là do cht kháng sinh ngoi bào không có bn cht
polypeptide. Gii trình t n gen 16S rRNA cho thy ch
ng 99,1% vi Lactococcus lactis CC4K, chng 99% vi
Bacillus subtilis ctv., 2007).
Ngoài ra, Talpur et al. (2012)t hn hp vi

ging khuch tán).
Hình 2.1 Kh kháng khun ca mt s chng vi khun lactic
(Ghi chú:2 vòng tròn vô trùng với vi khuẩn chỉ thị P. pentosaceus (A, 1A, 2A, 3A-
dịch vi khuẩn chưa qua lọc; 4A, 5A, 6A-dịch vi khuẩn qua lọc), B. coagulans (B)
and E. ictaluri (C); 1C vòng kháng khuẩn lớn; 2C-trung bình và 3C-nhỏ) của những
dòng vi khuẩn lactic theo phương pháp giếng khuếch tán (Nguyen Thanh Tam et al,
2012).)

Vi khun lactic có th nh danh bn thng bng
vic kim tra các ch tiêu sinh hóa, tuy nhiên  thm hin ti vinh 10

dang vi khun bc phân t s cho kt qu chính xác,
   u. nh danh b   c phân t
(gii trình t gen 16S-ARN). nh trình t rARN 16S ca các chng vi
khu    a Sakiyama et al. (2009). n gen 16S rRNA
gm khong 1542 nucleotid, 16S ribosomal RNA (16S rRNA) là b phn cu
 30S ca ribosomes  prokaryote. c
s dng cho nghiên cu v ngun gc phát sinh loài bi vì nó có tính bo toàn



3.1 
Thi gian thc hin t tháng 9/12n 12/12/2013. m tin
hành thí nghim: B môn Bnh hc Thu sn, Khoa Thu si hc Cn
.
3.2 
Dng c: ng nghiu nhit,
que cu col, pipet 10-100µl, pipet 100-1000µl,
: ly tâm,
Hóa chng: Mô s dng trong thí nghim gm có:
ng
             
   (NB) hoc BHIB (Brain-Heart Infusion Broth). Môi
ng BHIA (Brain-Heart Infusion Agar). Hóa cht nhum Gram, test
oxidase, catalase, CaCO
3.
Cn tuyi, ct, NaCl, parafin lng, parafin
giy.
Vt liu: Cá rô phi,  i mui chua    
pháp thu mu. Ngun vi khun E. ictaluri c cung cp t Bnh hc Thy
sn, Khoa Thy si hc C.
3.3 
3.3vi khurô phi 

thu mu: Sn phi mui chua) và cá
c thu  a bàn Thành ph Cu cho mi loi
sn phm ti mm). Thu tt c 12 mu.
ng pháp phân lp vi khun lactic t i chua và rut cá
rô phi (c thc hin d nghiên cu ca Ngô th 

này phi nng cy và không ln vi nhng khun lc có hình dng
và màu sc l. Chúng s     tin hành nhum Gram, th
catalase, th oxidase, và kim tra kh i CaCO
3
. Vi khun lactic
c xác nhn khi các dòng phân lp có hình tròn hoc hình que, không sinh
bào t, catalase âm tính, oxidase âm tính và phân gic CaCO
3
(Ngô th
và ctv., 2011). Nhng dòng vi khun lactic này s c nuôi
ng M  lc thí
nghim tip theo.
Vì vic thêm CaCO
3
  ng phân lp vi khu  i
không phc tp nên trong quá trình phân lp CaCO
3
c thêm vào môi
y ch nhng khun lng cha CaCO
3
thì
mc chn cho nhc tip theo.
 nh mt s m sinh hoá ca vi khun (
xem chi tit  ph lc B)
3.3E. ictaluri 

Tính kháng khun ca vi khuc kim tra b
khuych tán trên ging thch (well diffusion agar).
Chun b dch huyn phù vi khun ch th : Vi khun E. ictaluri c
nh danh và tr trong t âm (-80

4
0
 khuch tán các cht trong dch trong  các ging
trong 60 phút r   28-30
o
C cho vi khun ch th phát trin.
nh tính kháng khun ca vi khung kính vòng vô
khun quanh ming ging. Tính kháng khuc biu hing kính
vòng vô khun l sau khi tr a ging (Ngô Th
ctv, 2011), hoc ln 1mm theo Nguy
Nguyn Ngc Trai, 2012. So sánh kh   n ca các dòng và
chn lc nhng dòng vi khun lactic có kh n cao.
3.3.3  
Hai dòng vi khun ln nht s c ly
trích ARN ti Khoa Thy sn, i hc Ci mn công ty
TNHH TM và DV Nam Khoa  nh danh bi trình t
gen 16S- rARN. 14

4
T  VÀ 
 
i và cá rô phi còn sng c thu mua và vn chuyn t các ch
thua bàn Thành ph C phòng thí nghim Khoa Thy sn, i
hc Cng thi gian ngn không quá mt gi. Ngay sau khi
 phòng thí nghim mc x lý và phân lp vi khun lactic, sau 2
ngày nhng khun lm khác nhau v ngun gc, hình dng,
màu sc s c tách ròng tip tc my ròng, và

Hình 4.2 Kh ni CaCO
3
ca vi khun lactic trên MRS agar
b sung 0,5% CaCO
3
(A), mu nhum Gram (Gram (+)) tiêu biu (B).
Trong quá trình thí nghim, 34 chng vi khun lactic c phân lp
ng t i mui chua và 20 chng t rut cá rô phi (xem
ph lc C). Các chng phân lc quan sát hình thái khun lc, quan sát t
i kính hin vi. Kt qu nhuu âm tính
u có kh i CaCO
3
da theo các ch  cp trong
nghiên cu ca Dung et al. (2011)ng chi nhn thông tin chung
v các dòng vi khun phân lc.
Bng 4.1 Kt qu kim tra so sánh các ch n ca vi khun
c phân lp.

Lactobacillus sp. (*)
V(**)
Gram
+
+

Que

Catalase

Lactobacillus sp và còn có thêm nhng dòng vi khun khác ging
Lactobacillus sp.
 Edwardsiella ictaluri
 tán (Well diffusion agar)
    kt qu có 9 chng vi khun lactic to vòng
kháng khun vi vi khun ch th Edwardsiella ictaluri (xem Bng 4.1 và 4.2).
Chim 26% tng s chng phân lc.
, 2 chng vi khun ng kính vòng vô
khun ln nht lt là 12 mm và 10,3 mm có kh cao vi vi
khun ch th ng kính vòng vô khun lc
trong nghiên cu ca Ngô Th  , 2011 ). Hai chng RP312 và
ng kính vòng vô khun nh nht lt là 0,3 mm và 0,7 mm
c coi là không có kh i kháng vi vi khun ch th ng kính
vòng vô trùng nh c ca Galindo (2004); trích dn bi
Nguyguyn Ngc Trai, 2012).
ging khuch c thc hin vi 2 nghim thc và ba
ln lp li  mi nghim thc. Vi khun ch th Edwardsiella ictaluri trong thí
nghic cung cp t B môn Bnh hc thy sn, Khoa Thy si hc
C  c khi tin hành thí nghim chng vi khun E. ictaluri c
kim tra các ch alase, oxidase và nhum Gram.
Nghim thc th nht
Tin hành ly tâm dung dch vi khun sau 2 ngày nuôi  8000 vòng/phút,
trong 15 phút  nhi 4
0
C. Thu 100µl phn dch trong bên trên cho
vào ging thc to bng kính 6 mm, trên môi trng
 thc hing khuch tán.