TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
PHAN THI BÍCH NGOC
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM
SÚ
Luận văn tốt nghiệp đại học Ngành: CÔNG NGHỆ THựC PHẲM
&
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THựC PHẨM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM
sú
Giảo viên hưám.2 dẫn: PGs.Ts.
Nguyễn Văn Mười
Sinh viên thưc hiên:
Phan Thị Bích Ngọc
MSSV: 2101943
Lóp Công nghệ Thực phẩm K36
Cần Thơ, 2013
w
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Phan Thị Bích Ngọc với
sự hướng dẫn của PGs. Ts. Nguyễn Văn Mười. Các số liệu và kết quả trình bày trong
luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với
đề tài “Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú” đã được hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Người viết
Nguyễn Văn Mười
Người hướng dẫn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Phan Thị Bích Ngọc
của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc
biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận
protease từ thịt đầu tôm sú đã được khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng với
cấu trúc có tâm. Kết quả khảo sát cho thấy, dịch chiết protease thu được từ thịt đầu
tôm sú có hoạt tỉnh tối ưu là 13,48 u/g CKNL (chất khô nguyên liệu) khi sử dụng
dung dịch đệm glycine - NaOH với pH 9 làm dung môi trích ly với tỷ lệ nguyên liệu
và dung môi là 1: 4 (w/v). Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định
được điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu lần lượt là 46 °c và 44,6 phút.
Từ khóa: nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sứ, thài gùrn, tỉ lệ dung môi.
MỤC
LỤC
soOca
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH TỪ VIÉT TẮT
CCD Central Composite Design
CKNT Chất khô nội tạng
CKTĐT Chất khô thịt đầu tôm
CPE Chế phẩm enzyme
DC Dịch chiết
DFP Diisopropyl Fluoridate Phospho
Đvtn Đơn vị thí nghiệm
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EMS Early Mortality Syndrome
HLSO Head Less Shell On
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
LysNA Lys-P- Naphthylamide
PMSF Phenyl Methane Sulfonyl Flouride (PMSF)
SBTI Soya Bean Trypsin Inhibitor
RSM Response Surface Methods
vọng cho việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụng
triệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế cho
ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng.
Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình ché biến khoảng 34% khối lượng ban
đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 -ỉ- 46.000
tấn đầu tôm được thải ra tà các nhà máy. Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu dùng làm
phân bón, thức ăn gia súc, thủy sản. Tuy nhiên giá trị thành phẩm của các sản phẩm
này chưa cao. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời gian gần
đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm, đây được
xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng như thực phẩm mà
không hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh (Trung et al., 2003). Tuy nhiên,
việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng thịt trong đầu tôm (chiếm đến
15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên liệu tôm SÚ tươi), tạo ảnh hưởng
tiêu cực đến môi trường. Chính YÌ thế, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử
dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme protease nhằm nâng cao giá trị
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 7
thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá
trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp thiết.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu
quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài
tập trung vào các nội dung cụ thể sau:
> Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly protease thích hợp.
> Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease
Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease tò
thịt đầu tôm sú.
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 THỊT ĐẦU TÔM sú - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME
PROTEASE
tôm tăng trên toàn cầu. Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị trường
lớn tăng lên.
Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu trong
cả nước. Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt hàng
tôm sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả nước và
56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm. Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng lượng xuất
khẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất. Trong đó, mặt hàng
tôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị trường, đặc biệt trên
thị trường Nhật Bản. Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối tháng 6/2013 tăng thêm
5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên 16,23 USD/kg. Tôm sú HLSO
cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ
11,3 USD/kg lên 15,95 USD/kg.
(Nguồn: http://www. vasep. com. vn/Tin-Tuc/378_30440/Hien-trang-va-tiem-nang-thi-truong-xuat-
khau-tom- Viet-Nam. htm)
Tình hình hiện nay mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chế
biến các sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam.
2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta
Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy,
đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3)
khi so sánh YỚi pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 6,9; Nguyễn Xuân Phương,
2003). Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và
các biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 9
Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon
(Nguồn: http://healthyrecipes.wikia.com/wikƯFiỉe:Bỉack_Tiger_Prawn_Jumbo_Size.jpg)
2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam
Một trong những ứng dựng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến chitin,
chitosan. Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008 cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền
xử lý bằng acid formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu
2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 11
o
Amino
component
- Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các
ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptidase
tạo phức họp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhóm
aspartic peptidase. Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pH
trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA.
- Serine peptidase: Là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serine trong
trung tâm hoạt động. Các peptidase serine này thường là hoạt động ở vùng pH
khá rộng tò trung tính đến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm -CO
của liên kết peptide tạo họp chất trung gian acyl-enzyme. Các enzyme thuộc
nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin. Chúng bị ức chế bất
thuận nghịch dưới tác dụng diisopropyl-phosphofluoridate (DFP),
phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức chế
thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin.
Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vực
nhất là nhóm serine protease do chứng có khả năng thích ứng trong khoảng
pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụng
nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác. Đặc biệt được ứng dụng
rộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa. Hiện nay nhóm
serine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác
nhau với các tên thông dụng ở bảng 2.2.
Endopeptidase
NHiCHCOr NHCH NHCHCO - NHCHCONHCHCO NHCHCOOH
R4 R
Đầu c các amin
Hệ thống tiêu hóa ở động vật
(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2010)
2.2.2 Hệ serỉne protease
H
I*
$#
>’
A
a
P
i.
I
i
r~{
HI
s«
IM / ~H1B2
I í I
o H I«'"" N H o Ỹ
o
liu
-N—c Ç
N-
Ö _ I lì H
H I H
-N—c— Ç —N —c
—Ç-
« ^ I H I I
kA "
-c
-
I
■N- ç
-
N
c
o
Cơ chế theo hình 2.4 gồm 3 phản ứng:
Phản ứng 1: Nhóm -0H của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hựp với
nhóm c=0 của liên kết peptide trong chuẫỉ polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ
diện (tretáhedral complex).
Phản ứng 2: Ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển
diện tích lên o tạo nhóm c=0 mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch
polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu c còn lại và
khôi phục trung tâm hoạt động củã serỉne protease.
Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt
là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung tâm
hoạt động nhóm serine (Hình 2.5).
Val2, eU H«" « °
Eỉastasũ
Hình 2.5 Hình dạng các gốc
amlno acid ờ các túi khác
nhau của serine protease
(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2011)
Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau
sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của từng
serine proteỉn khác nhau.
Phần lớn các nhỏm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của
một enzyme:
- Hòa tan được ữong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung
tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính
này để tách chiết chúng.
- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol,
acetone để thu nhận chế phẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt
hóa hay ức chế.
- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ, pH
môi trường.
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) về protease đầu tôm biển
và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme
tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm.
Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở
môi trường gần trung tính.
Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau. Theo
một số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạng
cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 -^4,33
lần).
Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme, còn
đầu tôm thì lại có thêm cả phần yỏ và thịt tôm có ít hoạt tính sinh học. Hoạt tính
protease cao của nội tạng tôm cũng giúp giải thích, sự hư hỏng xảy ra thường thấy
nhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản tôm đã bỏ đầu, tách chỉ bao
giờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế biến và bảo quản (Nguyễn Lệ
Hà, 2011).
Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở vùng trung
tính pH = 7 và giảm dần khi pH tăng ứong vùng điều kiện, điều này phù hợp với đặc
điểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động ứong môi trường acid
nhanh khỏi. Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng trong điều trị bệnh tim
mạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: Từ động vật, thực vật,
đến vi sinh vật, chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân
fibrin, fibrinogen.
- Trong nông nghiệp: Protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm
tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử
dụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn họp
protease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi
trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường
nước nuôi.
Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi ứong một số ngành khác như công nghiệp
thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không làm
ảnh hưởng đến chất lượng da. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng
tẩy vết bẩn có thành phần là protein.
(Phan Thị Bích Trâm, 2011)
2.2.4.2 ửng dụng của protease Mần nguồn gốc động vật
Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế giới
(Godfrey và West, 1996). Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi khuẩn
được ứng dụng rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như Alkazym
(Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork, USA),
Ultrasil (Henkel, Dusseldorf, Đức), còn có nhiều enzyme nguồn gốc động vật, điển
hình như Pronod 153 L được ly trích từ máu, keratin protease (trích ly từ da, lông
heo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà phòng, xử lý
chất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy phân dịch
protein các phụ phẩm của thủy sản.
2.3Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT
2.3.1 Lý thuyết chung
Giai đoạn đầu của quá trình tách chiết enzyme là thu nhận dịch chiết từ một yật liệu
sinh học nghiền nát sơ bộ nào đó (bột, mầm thóc, hạt nảy mầm, một mô động vật nào
2
/giây.
Xa: Phân mol chất A trong hệ thống.
z: Khoảng cách khuếch tán (m).
Dấu (-) về mặt vật lý nghĩa là quá trinh khuếch tán xảy ra theo chiều giảm nồng độ
của chất khuếch tán.
Nói cách khác, vận tốc truyền của một quá trình truyền tỷ lệ thuận YỚi động lực của
quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lực của quá trình (McCabe et al., 1993). Động lực
của quá trình ly trích enzyme phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa
dung môi và cơ chất rắn (Lonsane và Krishnaiah, 1992); chịu sự chi phối của mức độ
xuyên thấu của dung môi vào cơ chất (mô tế bào động vật, nguyên liệu sử dụng trích
ly enzyme) hay khoảng cách khuếch tán - trở lực của quá trình ly trích (Harris,
1995).
Dựa ừên phương trình (2.1), hiệu quả của quá trình ly trích phụ thuộc vào một số yếu
tố cơ bản:
- Sự chênh lệch nồng độ.
- Diện tích tiếp xúc.
- Khả năng hòa tan của chất tan (hay enzyme) vào dung môi.
- Độ nhớt của dung môi.
- Khả năng khuếch tán của dung môi vào bên trong cơ chất rắn.
- Nhiệt độ trích ly.
- Tốc độ khuấy trộn để cải thiện hiệu quả khuếch tán.
(Rao, 2010)
Đối với quá trình ly trích cơ chất rắn từ dung môi lỏng nói chung và enzyme nói
riêng, quá trình khuếch tán chất tan vào dung môi còn chịu ảnh hưởng của đặc tính
liên kết của enzyme và cơ chất, điển hình như tương tác kỵ nước, liên kết hydrogen,
lực Val de Walls (Palit và Banerjee, 2001).
Nói cách khác, đặc điểm của nguồn nguyên liệu - một trong những động lực thúc đẩy
sự chênh lệch nồng độ của enzyme trong cơ chất và dung môi, các điều kiện ly trích
như loại dung dịch đệm, pH của dung dịch sử dụng ly trích, thời gian cũng như nhiệt
vào nguồn gốc sản sinh ra chúng. Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật,
thực vật cao hơn động vật. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định mà thay
đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của
enzyme (Rao, 2010).
Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến
hoạt tính enzyme. Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia
tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm
thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích protease.
Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức
chế hoạt động của enzyme. Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời gian ly trích
dài. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích
thước nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dung
môi, khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với đường đi quanh co, kết
quả là khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993). Ở cùng tỷ lệ dung môi sử
dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên
liệu để khuếch tán enzyme, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Rao, 2010).
2.4 QUY HOẠCH THựC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY
THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng YỚi mô hình phức hợp tại tâm (CCD) thường được sử
dụng để mô phỏng điều kiện hoạt động tối ưu của một quá trình thông qua các
phương pháp thực nghiệm, cấp độ khác nhau hoặc các giá trị của điều kiện hoạt động
bao gồm các yếu tố trong mỗi thí nghiệm. Các yếu tố này có thể là yếu tố phân loại
(ví dụ nguồn nguyên liệu sử dụng) hay định lượng (tỷ lệ thành phần khảo sát, nhiệt
độ, .)• Tuy nhiên, trong thực tế, các biến phân loại phải được xử lý một cách riêng
biệt bằng cách so sánh các điều kiện hoạt động tốt nhất đối với các biến đinh lượng
qua sự kết hợp khác nhau (Lenth, 2011).
Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phân
tích phương sai để xác định giá trị của các hệ số ừong phương trình hồi quy đa thức.
Tùy theo loại thực nghiệm mà phương trình hồi quy là tuyến tính hay phi tuyến
(Giovanni, 1983). Các dạng phương trình hồi quy thường áp dụng đối với lĩnh vực
u
: Là hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời hai nhân tố Xj và
Xu đối với y.
bjj: Là hệ số hồi quy bậc 2 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj đối với y. k: Là số
yếu tố khảo sát (Xj Xk).
MÔ hình thống kê thực nghiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu
chuẩn thống kê (Student và Fisher) (Cheynier et al., 1983).
2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY
VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT
2.5.1 Nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu trích ly proease từ các nguồn động yật đã bắt đầu được quan tâm trong
thời gian gần đây. Nguyễn Lệ Hà (2011) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và ứng
dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản. Kết quả
thu nhận enzyme protease tinh sạch. Chế phẩm enzyme (CPE) protease từ đầu (hoặc
gan tụy) tôm sú có thể thu nhận được qua các bước cơ bản: Chiết rút enzyme từ
nguyên liệu đã nghiền nhỏ bằng Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 YỚi tỉ lệ 1: 3 (w/v), thời
gian chiết 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy). Dịch chiết (DC)
thu được bằng cách cho qua rây có lỗ với kích thước 1 mm
2
để loại lượng lớn vỏ tôm,
sau đó ly tâm 6000 vòng/phút (rpm), 15 phút, loại cặn đem làm thức ăn gia súc. Kết
tủa DC bằng ethanol với nồng độ 80%, 50 phút để điều chế CPE từ đầu tôm hoặc
bằng (NH4)2SC>4 70%, 70 phút để thu CPE từ gan tụy tôm. Công đoạn ly tâm thu
CPE cũng được thực hiện ở 6000 rpm trong 15 phút.
Trước đó, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man (2006) cũng đã đề xuất thu nhận chế
phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm
thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/gCKNT (chất khô nội tạng)
trong điều kiện tỷ lệ mẫu và dung môi sử dụng là 1: 1 (w/v); pH 9,5; nhiệt độ 35 °c
và thời gian chiết 10 phút. Dung môi isopropanol là tác nhân thích họp nhất để kết
tủa protease trong dịch chiết từ ruột cá basa. Với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và
7,0). Hoạt động của endoprotase tăng từ 5 7,4 lần đối với NPS-I và SS-I, và 1,9 +
2,7 lần đối với NPS-II và SS-II. Trong khi đó, exoprotease tăng từ 3,6 -ỉ- 4,8 lần đối
với NPS-I và SS-I, và 5,6 7,2 lần đối với NPS-II và SS-II.
Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụng
protease từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:
- Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp protease.
- Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng loại
enzyme và nguồn nguyên liệu, trong đó tỷ lệ dung môi sử dụng để hòa tan
enzyme, tác động của pH, nhiệt độ và thời gian trích là các yếu tố có tầm quan
trọng cao nhất.
- Việc xác định các tính chất cơ bản của enzyme là cơ sở bước đầu trong việc
dự đoán đặc điểm, phương thức hoạt hóa và lĩnh vực ứng dụng của protease
khảo sát.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
■
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm
Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí
nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng,
Trường Đại học cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013.
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm
- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,0 lg, Nhật.
- Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật.
- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc.
- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1, Ý.
- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý.
- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ cấp đông -25 °c,
Nhật.
- Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật).
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Thịt đầu tôm sú sau khi đưa về phòng thí nghiệm được rửa sơ bộ, để ráo nước,
phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định (khối lượng mẫu sử dụng cho một
đơn vị thí nghiệm là 200 g/mẫu), bao gói trong bao bì PA và trữ đông ở -18 ± 2 °c.
3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú
Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ phù hợp. Nhiệt
độ dung môi trước khi phối trộn là 2 4 °c. Tiếp theo, hỗn hợp được nghiền
bằng
máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3
phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu. Trong quá trình nghiền, nhiệt độ
không vượt quá 5 °c (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man, 2006).
Sau khi nghiền, mẫu được đổ vào cốc thủy tinh, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian
khác nhau để chiết rủt enzyme. Chú ý khuấy đảo mẫu 5 phút/lần. Dịch chiết thu
được bằng cách cho vải lọc có lỗ với kích thước lmm *l m m
để loại lượng lớn
phần chất khô không hòa tan (bã tôm), sau đó làm lạnh (bằng cách cho dịch sau lọc
vào tủ đông) trong 15 phút trước khi chuyển sang ly tâm 3000 rpm ữong thời gian
20 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết, gọi là dịch chiết protease thô (Yaneza
et al., 2004).
Tiến hành xác định hoạt tính protease trong dịch chiết enzyme thô nhằm chọn
được điều kiện trích ly protease tốt nhất.
3.2.4 Phưong pháp phân tích và đo đạc kết quả
3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại ít nhất 3 lần. Thông số tương ứng với
kết quả khảo sát đã lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định
cho thí nghiệm kế tiếp.
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution
16.1, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD hay Duncan để kết luận về
sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
Copyright: Tài liệu đại học ©