TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN CAO THỊ KIỀU TIÊN KHẢO SÁT TỒN LƢU KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOLE VÀ TRIMETHOPRIM
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ
RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
Th.S TRẦN MINH PHÖ
2013



ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này ngoài nỗ lực riêng
bản thân tôi còn nhận đƣợc không ít sự giúp đỡ và động viên từ phía rất nhiều
ngƣời. Nay tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Thầy Trần Minh Phú đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt những kiến thức
quý báo cho tôi trong suốt thời gian qua.
Quý thầy cô Bộ môn Dinh Dƣỡng và Chế Biến, khoa Thủy Sản, trƣờng
Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức chuyên môn trong suốt quá trình học
tập. Tạo các điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn.
Chị Huỳnh Thị Ngọc Liên, phó phòng kiểm nghiệm Trung tâm kiểm
nghiệm chất lƣợng nông lâm thủy sản Vùng 6 đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi
có cơ hội tìm hiểu học hỏi tại trung tâm.
Anh Cô Hồng Sơn nhân viên phòng kiểm nghiệm đã hƣớng dẫn tận tình
cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại trung tâm.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và
động viên tôi trong suốt khoảng thời gian học tập vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện Cao Thị Kiều Tiên
lƣợng SMX là 726±60,4 µg/kg; TMP là 203±93 µg/kg, trên cơ cá tra có tồn
lƣu SMX là 577±180 µg/kg; TMP là 92,5±83,7 µg/kg, và trên cơ cá rô phi có
mức tồn lƣu SMX là 604±255 µg/kg và TMP là 137±52,5 µg/kg ở ngày thứ 5.
Kết quả khảo sát dƣ lƣợng SMX, TMP trên cá tra cho thấy tồn lƣu trên
da lâu hơn trên cơ. Tồn lƣu SMX trên da sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc là
144±44,5 µg/kg, tồn lƣu TMP là 30,1 ±15,7 µg/kg. Kết quả phân tích trên cơ
thịt cá tra sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc của SMX là 40,5±15,9 µg/kg, của
TMP là 14±5,19 µg/kg. Sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc tồn lƣu cả hai kháng
sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên da cá tra đều thấp hơn giới hạn
cho phép theo tiêu chuẩn của châu Âu và FDA của Mỹ (100 µg/kg đối với
sulfamethoxazole và 50 µg/kg đối với trimethoprim). Tồn lƣu trên cơ và da cá
rô phi có thời gian đào thải nhanh hơn đối với cá tra. Sau 3 ngày ngừng cho ăn
thuốc tồn lƣu của SMX và TMP thấp hơn giới hạn cho phép (SMX là
38,5±11,4µg/kg, TMP là 28,2±13,9µg/kg so với quy định của Châu Âu và
FDA, Mỹ (SMX là 100 µg/kg, TMP là 50 µg/kg). iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
SMX Sulfamethoxazole
TMP Trimethoprim
SDZ Sulfadiazin
SAs Kháng sinh nhóm Sulfamid
OMP Ormethoprim
BNNPTNT Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn
HPLC High Performance Liquid Chromatography
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
LC – MS/ MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry
ppm Parts per million

CHƢƠNG 1 1
GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1
1.3 Nội dung nghiên cứu 1
1.4 Thời gian thực hiện 1
CHƢƠNG II 2
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh 2
2.1.1 Định nghĩa 2
2.1.2 Nguyên nhân tồn lƣu kháng sinh trong thực phẩm 2
2.1.3 Tác hại của kháng sinh 2
2.2 Sơ lƣợc về Sulfamid (SAs) 2
2.2.1 Sơ lƣợc về nhóm Sulfamid (SAs) 2
2.2.2 Sulfamethoxazole (SMX) 3
2.3 Sơ lƣợc về Trimethoprim (TMP) 4
2.3.1 Công thức cấu tạo: C
14
H
18
N
4
O
3
4
2.3.2 Tính chất 5
2.3.3 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng 5
2.4 Thuốc thú y thủy sản Trimesul của Vemedim 5
2.5 Tổng quan về cá tra 6
2.5.1 Phân loại 6

3.2.3 Phƣơng pháp phân tích 13
3.3 Thí nghiệm: Xác định thời gian tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên nguyên liệu cá tra và cá rô phi đỏ 16
3.3.1 Xác định thời gian tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong mẫu thức ăn thí nghiệm. 16
3.3.2 Xác định thời gian tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong nuôi cá tra 16
3.3 Xử lí số liệu 17
CHƢƠNG 4 18
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1 Thí nghiệm xác định tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên cá tra 18
4.1.1 Yếu tố môi trƣờng 18
4.1.1.1 Nhiệt độ 18
4.1.1.2 pH 18
4.1.1.3 Oxy hòa tan 19
4.1.2 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn. 19
4.1.3 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trong da cá tra. 19

vii

21
4.1.4 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trên cơ cá tra 21
4.2 Thí nghiệm xác định tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên rô phi đỏ 23
4.2.1 Yếu tố môi trƣờng 23
4.2.1.1 Nhiệt độ 23
4.2.1.2 pH 24
4.2.1.3 Oxy hòa tan 24
4.2.2 Tồn lƣu trên cá rô phi 25

Bảng 2.2 Mức độ tồn lƣu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau 7 ngày
ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh (ng/g) 11
Bảng 2.2 Điều kiện phân mảnh 11
Bảng 4.1: Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18
Bảng 4.2 pH trung bình trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18
Bảng 4.3 Lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc trong quá trình thí nghiệm trên cá tra
19
Bảng 4.4a Tồn lƣu SMX và TMP trên da cá tra trong 5 ngày cho ăn kháng
sinh 19
Bảng 4.4b Tồn lƣu SMX và TMP trên da cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn
kháng sinh 20
Bảng 4.5 Tồn lƣu SMX và TMP trên cơ cá tra trong 5 ngày liên tiếp cho ăn
thức ăn chứa kháng sinh 21
Bảng 4.6 Tồn lƣu SMX và TMP trên cơ cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc
22
Bảng 4.7 Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 23
Bảng 4.8 Giá trị pH trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24
Bảng 4.9 Hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24
Bảng 4.10 Tồn lƣu SMX và TMP trên cá rô phi trong thời gian cho ăn thức ăn
chứa kháng sinh 25
Bảng 4.11 Tồn lƣu SMX và TMP trên cá rô phi sau 15 ngày ngừng cho ăn
chứa kháng sinh 25
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Năm 2012, tổng sản lƣợng thủy sản của cả nƣớc đạt 5.876 nghìn tấn,
tăng 8,8% so với kế hoạch (Bộ Nông Nghiệp, 2013). Sản lƣợng nuôi trồng
thủy sản đạt gần 1.759 nghìn tấn, tăng 3,1 % so với cùng kỳ năm trƣớc. Sản
lƣợng cá tra năm 2012 đạt 1,2 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 1,8 tỷ đô
la Mỹ (VASEP, 2013). Sự tồn lƣu kháng sinh trên sản phẩm thủy sản, đặc biệt
là cá tra đang ngày càng đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt.
Trong nuôi cá tra, một số loại kháng sinh đƣợc sử dụng nuôi phổ biến
nhƣ: Florfenicol, doxycycline, sulphonamide kết hợp với trimethoprim, (Phú
et al., 2012). Sulfamide là một nhóm kháng sinh có phổ tác dụng mạnh đối với
các vi khuẩn gây bệnh gram âm và dƣơng. Khi kết hợp với trimethoprim thì
khả năng kháng khuẩn này tăng cao và hạn chế độc tính của sulfamide đơn
thuần. Việc sử dụng hổn hợp kháng sinh này sẽ dẫn đến tồn lƣu trên cá tra.
Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu về thời gian đào thải của hai loại kháng sinh
này trên cá tra và cá rô phi đỏ nuôi. Chính vì vậy việc thực hiện đề tài “Khảo
sát tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra và cá rô
phi đỏ” là cần thiết.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định thời gian tồn lƣu và dƣ lƣợng của kháng sinh
sulfamethoxazole và trimethoprim trong cá tra và cá rô phi đỏ.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Xác định thời gian tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong mẫu thức ăn, trong mẫu cơ cá tra, da cá tra và cơ cá rô phi
đỏ
1.4 Thời gian thực hiện
Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013

chuyển hóa chất của sulfanilamid do thay thế nhóm –NH
2
hoặc –SO
2
NH
2
. Là
dạng bột trắng rất ít tan trong nƣớc, tan nhanh hơn trong huyết thanh (Võ Văn
Ninh, 2007).
Nhóm kháng sinh Sulfamid gồm các loại chính sau: sulfadimidin,
sulfadimethoxin, sulfamerazin, sulfadiazine, sulfamethoxypyrimidin,
sulfapyridin. Giới hạn tồn lƣu cho phép trong thủy sản của SAs (các loại) là
100µg/kg theo quy định của Cộng đồng Châu Âu.

Trang 3

Sulfamid là kháng sinh kìm khuẩn, chúng ức chế dihydrofolat
synthetase – một enzyme tham gia tổng hợp acid folid. Sulfamid có cấu tạo
khá giống PABA (Para Amino Benzoic Acid), là một nguyên liệu rất cần thiết
cho vi khuẩn để tổng hợp acid folid phục vụ cho quá trình phát triển. Chính vì
vậy mà sulfamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid
folic của vi khuẩn (Võ Văn Ninh, 2007).
Phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, hầu hết các cầu khuẩn và các
trực khuẩn gram âm và dƣơng:
- Cầu khuẩn gram (+): liên cầu, phế cầu, tụ cầu (tụ cầu vàng)
- Cầu khuẩn gram (-): màng não cầu, lậu cầu
- Trực khuẩn gram (+): ƣa khí và kỵ khí
- Trực khuẩn gram (-): đặc biệt là trực khuẩn đƣờng ruột
- Một số sulfamid tác dụng với clamydia, ký sinh trùng sốt rét,
toxoplasma.

S

Hình 2.1 Công thức cấu tạo SMX

Trang 4 Sulfamethoxazole là 4 – amino – N – (5 – methylisoxazol – 3 – yl) –
benzenesulfonamide.
Tính chất
Sulfamethoxazole bột trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, vị đắng, không
tan trong nƣớc, ít tan trong ethanol
Màu sắc của dung dịch
Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch natri hydroxyd 1 M
(TT). Dung dịch thu đƣợc có màu không đƣợc đậm hơn dung dịch màu mẫu.
Giới hạn acid
Lấy 1,25 g chế phẩm đã đƣợc nghiền mịn, thêm 25 ml nƣớc không có
carbon dioxyd, lắc đều. Đun nóng khoảng 70
0
C trong 5 phút. Làm nguội trong
nƣớc đá khoãng 15 phút và lọc. Hút 20 ml dịch lọc, thêm 0,1 ml dung dịch
xanh. Bromothymol (TT), không đƣợc dùng quá 0,2 ml dung dịch natri
hydroxyd 0,1 M (CĐ) để làm
chuyển
màu của chỉ thị.
Tác dụng
Sulfamid ngày càng ít dùng đơn thuần vì nhiều độc tính và đã có kháng


Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin,
phải chứa từ 98,5đến 101,% C
14
H
18
N
4
O
3
, tính theo chế phẩm đã làm khô.

Trang 5

2.3.2 Tính chất
Bột trắng hoặc trắng hơi vàng. Rất khó tan trong nƣớc, khó tan trong
ethanol 96%, tan ít trong chloroform, thực tế không tan trong ether.
2.3.3 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng
Trimethoprim có tác dụng kìm khuẩn, ức chế enzym dihydrofolate
– reductase của vi khuẩn. Trimethoprim chống lại tác nhân gây nhiễm khuẩn
đƣờng tiết niệu nhƣ E.coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter,
Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi
khuẩn dạng E. Coli
Trimethoprim đƣợc hấp thu nhanh và hầu nhƣ hoàn toàn qua đƣờng

2.5.1 Phân loại
Bộ cá nheo Siluriformes
Họ cá tra Pangasiidae
Giống cá tra dầu Pangasianodon
Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878, Fish base).
2.5.2 Phân bố
Cá tra phân bố ở lƣu vực sông Mekong, có mặt ở cả 4 nƣớc Lào, Việt
Nam, Campuchia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lƣu vực sông
Mekong và Chao phraya.
Ở nƣớc ta những năm trƣớc đây, khi chƣa có cá sinh sản nhân tạo, cá
bột và cá giống đƣợc vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trƣởng thành chỉ
thấy trên ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên. Việt Nam đã thành công trong sinh
sản nhân tạo và đã đáp ứng đƣợc nhu cầu về giống cho nghề nuôi thƣơng
phẩm.
Cá tra là một trong những loài cá có giá trị kinh tế phổ biến ở Đồng
bằng sông Cửu Long. Đây là loài cá có kích thƣớc lớn, dễ nuôi, tăng trọng
nhanh. Hiện nay cá tra có nguồn gốc sinh sản nhân tạo đã đƣợc thả nuôi ổn

Trang 7

định và là một trong những đối tƣợng nuôi trồng thủy sản đang đƣợc phát triển
với tốc độ nhanh tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Năng suất nuôi cá Tra
rất cao, trong ao đạt tới 60 – 70 tấn/ ha, trong bè có thể đạt tới 100 –
300kg/m
3
nƣớc bè nuôi. Tập trung nhiều tại An Giang và Đồng Tháp, và là
một trong những loài cá có giá trị xuất khẩu cao.
Cá tra ngoài tự nhiên phân bố ở những sông, hồ, kinh, rạch, mƣơng
vùng nƣớc ngọt, sống ở các thủy vực nƣớc tĩnh và nƣớc chảy. Cá cũng đƣợc
nuôi với hình thức nuôi bè, ao, hầm.

trọng nhanh hơn có khi đạt tới 5 – 6kg/con/năm. Tùy môi trƣờng sống và sự
cung cấp thức ăn cũng nhƣ loại thức ăn có hàm lƣợng đạm nhiều hoặc ít. Độ

Trang 8

béo của cá tăng dần theo trọng lƣợng và nhanh nhất ở những năm đầu. Cá đực
thƣờng có độ béo cao hơn cá cái và độ béo thƣờng giảm đi khi vào mùa sinh
sản.
2.5.7 Thành phần dinh dƣỡng cá tra
Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng cá tra trên 100g thành phẩm
Thành phần dinh dƣỡng
Giá trị
Tổng năng lƣợng (cal)
124
Tổng đạm (Kcal)
30,8
Tổng béo (g)
3,42
Chất béo bão hòa (g)
1,64
Cholesterol (mg)
25,2
Natri (mg)
70,6
Carbohydrat (g)
0
Chất xơ (g)
0
Protein (g)
23,4

C. Trên 32
0
C tốc độ tăng trƣởng và tiêu thụ thức ăn tỷ
lệ nghịch với quá trình tăng nhiệt độ. Khi nhiệt độ dƣới 20
0
C cá tăng trƣởng
chậm và ngừng ăn khi dƣới 15
0
C. Dƣới 10
0
C tỷ lệ cá chết rất nhiều. Giới hạn
nhiệt độ gây chết là 11
0
C và 42
0
C (Nguyễn Việt Dũng, 2008)
2.6.4 Đặc điểm dinh dƣỡng
Sau một tháng tuổi cá con có thể đạt trọng lƣợng 2 – 3g/con và sau
khoảng 2 tháng tuổi có thể đạt 10 – 12g/con. Cá cái sẽ lớn chậm hơn sau khi
tham gia sinh sản trong khi đó cáđực vẫn lớn bình thƣờng vì vậy trong đàn cá
rô phi thì cá đực bao giờ cũng có kích thƣớc lớn hơn cá cái. Sau khoảng 5 – 6
tháng nuôi cá rô phi vằn đực có thể đạt 200 – 250g/con và cá cái có thể đạt
150 – 200g/con.
2.7 Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng Sulfamid và Trimethoprim
2.7.1 Phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng sulfamid theo TCN196:2004:
Sulfamid trong sản phẩm thuỷ sản – Phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc kí
lỏng hiệu năng cao HPLC.
Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004, qui định phƣơng pháp xác định
hàm lƣợng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin,
sulfamethazin, sulfamethoxypiridazine, sulfacloropyridazin, sulfadoxin,

PO
4
0,02 M
Hỗn hợp dung dịch methanol và
acetonitril (tỷ lệ1:1)
Bắt đầu
60
40
20 phút
60
40
25 phút
50
50
39 phút
50
50
40 phút
45
55
50 phút
45
55
51 phút
60
40
58 phút
60
40


TMP
SDZ
TMP
SDZ
TMP
SDZ
TMP
1
583
378
314
1158
359
829 2
186
200
298
1338
187
359
305
18155
3
301
222
1500
7613

80
23
12
2
SD - 251
156*
80
21
20
92
80
31
16
3
STZ - 256
156*
85
19
18
92
85
33
14
4
SP - 250
92
85
31
10
156*

80
37
16
8
SMX - 254
156*
80
21
18
108
80
31
16

Trang 12

9
SSA - 268
156*
80
19
16
113
80
21
16
10
SDM - 311
156*
80 Trang 13

CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Bộ môn dinh dƣỡng và chế biến – Khoa Thủy sản – Trƣờng Đại Học
Cần Thơ
3.1.2 Nguyên liệu
Nguyên liệu cá tra giống, cá rô phi đỏ giống đƣợc mua từ trại cá giống
Cần Thơ.
3.1.3 Thời gian
Thời gian thực hiện từ tháng 8 – 2013 đến tháng 12 – 2013
3.2 Vật liệu và phƣơng pháp
3.2.1 Vật liệu
Cá tra có trọng lƣợng 40±7g/con và cá rô phi đỏ có trọng lƣợng 10±4g
không bệnh, không dị tật khỏe mạnh mua ở trại cá giống Cần Thơ. Cá đƣợc
thuần dƣỡng trƣớc khi tiến hành thí nghiệm 2 tuần.
3.2.2 Hóa chất
Thuốc Trimesul của Vemedim, thành phần chính gồm
sulfamethoxazole 20% và trimethoprim 6%.
Dầu mực
3.2.3 Phƣơng pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích sulfamethoxazole và trimethoprim bằng hệ
thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ LC – MS/MS đã đƣợc tối ƣu hóa tại
phòng thí nghiệm hóa Trung tâm chất lƣợng nông lâm thủy sản Vùng 6 (Địa

100 ppm , 10 ppm và 1ppm để sử dụng.
Đƣờng chuẩn sulfamethoxazole đƣợc pha theo các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8
ng/mL. Đƣờng chuẩn trimethoprime đƣợc pha theo các nồng độ 0, 10, 20, 40,
80 ng/mL.
 Điều kiện dung môi pha động
- A: Acetonitril (CAN)
- B: 0,1 % acid formic HCOOH trong nƣớc cất dùng cho UPLC
Chƣơng trình pha động:
Thời gian (phút)
%A
%B
0,00
20,0
80,0
1,00
20,0
80,0
2,50
35,0
65,0
4,00
40,0
60,0
5,00
60,0
40,0
5,20
20,0
80,0
6,50

291.2
123.2
230.2*
0.02
0.02
35
35
25
25
(*) Ion dùng để định lượng
 Tách chiết mẫu
- Cân 2 g mẫu phân tích
- Chiết bằng 10 mL dung dịch: 1% CH
3
COOH trong ACN
- Thêm 1mL nƣớc cất
- Lắc, đánh siêu âm 10 – 15 phút
- Thêm 2 g MgSO
4
và 1g NaCl lắc mạnh
- Ly tâm 6 phút, 4500 rpm
- Hút 5 mL dịch trên
 Làm sạch mẫu
- Chuẩn bị bột làm sạch bao gồm 900 mg MgSO
4
:150 mg PSA:100mg
bột C18
- Chuyển 5 mL dung dịch vừa chiết xong vào ống trên
- Thêm 0,5 mL toluen
- Ly tâm 6 phút, 4500rpm