BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
.

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS.

đào tạo đã tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành quá trình học tập tại
trường.
Cuối cùng, em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người đã luôn
động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như
ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2013.
Sinh viên
Phạm Thị Nga.

.

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.
3
1.1. TỔNG QUAN VỀ SULFAMETHOXAZOL.
3
1.1.1. Công thức cấu tạo.
3

18
2.1.1. Hóa chất, thuốc thử.
18
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ.
18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu.
19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
19
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích.
19
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích.
20
2.2.4. Ứng dụng phương pháp.
20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
20
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích.
20
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích.
20
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu.
22
2.3.4. Ứng dụng phương pháp.
23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
24
3.1. KHẢO SÁT VÀ TÌM ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ.
24
3.1.1. Xây dựng chương trình sắc ký.

44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.
46
KẾT LUẬN.
46
ĐỀ XUẤT.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.

PHỤ LỤC. .

DANH MỤC CÁC BẢNG


06

Kết quả khảo sát tính thích hợp

37

07

Kết quả khảo sát độ đúng

38

08
Kết quả khảo sát độ chính xác
39
09
Độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi
41
10

Kết quả hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong
một số mẫu nước thải bệnh viện
43
11
Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm
Phụ lục

13
04

Sơ đồ bộ phân tích ion bẫy tứ cực

14

05

Một số bộ phân tích khối khác

15

06

Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030

19

07

Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN-H
2
O : 1-1)

25

08
Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H
2


14

Sắc ký đồ mẫu sulfamethoxazol chuẩn nồng độ 0,05 µg/ml

34

15
Sắc ký đồ mẫu thử
35
16

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ
sulfamethoxazol
36

17

Sắc ký đồ khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng
40

18
Sắc ký đồ mẫu thử DHY (TXL)
Phụ lục
19

Sắc ký đồ mẫu thử DHY (SXL)

Phụ lục

.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN:
Acetonitril.
Full scan:
Kỹ thuật phân tích toàn thang.
HPLC:
High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao).
LC-MS:
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass

TXL:
Trước xử lý.
.
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát hiện ra kháng sinh và các đặc tính của chúng đã tạo ra một
cuộc cách mạng lớn trong y học, cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do
vi khuẩn gây ra. Hiện nay, kháng sinh là dạng thuốc được dùng phổ biến ở
nước ta, một quốc gia có mô hình bệnh tật chiếm tỷ lệ khá cao là nhiễm
khuẩn. Chính việc lạm dụng kháng sinh quá mức dẫn đến tình trạng kháng
thuốc nghiêm trọng. Hầu hết, các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra
môi trường dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư trong các
dụng cụ y tế, bông, băng, điều này đã góp phần vào sự tồn dư kháng sinh
trong nước thải, đặc biệt là trong nước thải bệnh viện. Không những thế,
lượng kháng sinh bằng các con đường khác nhau thải ra môi trường càng làm
gia tăng tình trạng đáng lo ngại này. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến
môi trường thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật của đất [28], [29], [30], [31].
Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình
chuyển hoá vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù
bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái
hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường.
- Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi
trường [28], [29], [30], [31].
Kháng sinh được thải ra môi trường bằng nhiều con đường khác nhau,
trong môi trường chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi
khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là
vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường.

.
3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.

1.1. TỔNG QUAN VỀ SULFAMETHOXAZOL [3], [4], [5], [6], [7], [9].
1.1.1. Công thức cấu tạo [4], [7], [24], [25]. Công thức phân tử: C
10
H
11
O
3
N
3
S.
Phân tử lượng: 253.28.
Tên khoa học: N
1
-(5- methyl-3-isoxasolyl) sulfanilamid.
1.1.2. Tính chất [4], [9], [10], [13], [14], [20], [24], [25].
 Tính chất lý học:
Bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà, không mùi, vị đắng nhẹ. Thực tế
không tan trong nước, tan 1 phần 50 trong ethanol 96%, tan 1 phần 3 trong
axeton, ít tan trong ether và cloroform, tan trong dung dịch kiềm loãng. Dạng
muối natri sulfamethoxazol dễ tan trong nước.
Nhiệt độ nóng chảy: 169
o

, Co
++

Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hóa, rồi ngưng tụ với α(β)-
naphton cho phẩm azoic màu đỏ cam. Người ta thường dựa vào nhóm này để
định lượng bằng phép đo nittrit với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột có iod
hoặc tropeolin 00 hoặc dùng điện kế. Nhóm amin thơm làm phân tử dược chất
rất dễ bị oxy hóa nên phải có các biện pháp chống oxy hóa thích hợp để ổn
định dược chất khi pha thành dung dịch.
1.1.3. Cơ chế tác dụng [5], [6], [9], [10], [11], [14].
Với nồng độ thấp, SMZ là một sulfamid kìm khuẩn, với nồng độ cao nó
có tác dụng diệt khuẩn. Một số vi khuẩn trong quá trình tổng hợp và chuyển
hóa acid folic thành nucleoprotein cần thiết cho cơ thể. Do SMZ có cấu trúc
tương tự acid para aminobenzoic PABA nên nó có khả năng tranh chấp cao
với chất này. Từ đó ức chế được dihydrofolat synthetase. SMZ ngăn cản tổng
hợp acid folic đồng thời ức chế dihydrofolat synthetase nên kìm hãm quá
trình chuyển acid folic thành acid dihydrofolic. Do đó, quá trình tổng hợp
acid folic (là 1 acid cần thiết cho quá trình tăng trưởng của các chủng vi
khuẩn nhậy cảm) bị ức chế ngay từ giai đoạn I.

.
5

Sulfamethoxazol

(-)


ococcus) nhưng SMZ còn rất đặc hiệu trong việc điều trị nhiễm khuẩn đường
tiết niệu (do Escherichia coli). Đặc biệt, với chứng lẹo mắt (sưng mí mắt cấp
tính) gây ra bởi vi khuẩn như Staphylococus (hiện nay thuốc nhỏ mắt có chứa
SMZ thường dùng với mục đích này).
1.1.6. Chỉ định [5], [7].
Dạng bào chế viên nén, thuốc tiêm thường kết hợp với trimethoprim
(sulfamethoxazol : trimethoprim theo tỷ lệ 5:1) dùng để điều trị các nhiễm
khuẩn do khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm: Nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục,
nhiễm khuẩn hô hấp (như viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa ) nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa vì dạng này có khả năng kháng khuẩn cao.
Thuốc nhỏ mắt có chứa natri sulfamethoxazol kết hợp với 1 số thành
phần khác (biệt dược Rhoto antibacteria) được dùng để điều trị trong các
trường hợp lẹo mắt, viêm kết mạc, viêm mí mắt. Ngoài ra, dùng để chống bội
nhiễm trong các trường hợp như loại bỏ các dị vật ra khỏi mắt.
1.1.7. Tác dụng không mong muốn [5], [7].

- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, tiêu chảy, viêm miệng, viêm lưỡi.
- Thận: Viêm kẽ thận, suy thận, sỏi thận.
- Da: Ban da, mày đay, mụn phỏng, hội chứng Steven- Johnson và Lyell.
- Máu: Thiếu máu hồng cầu to do thiếu acid folic, thiếu máu tan máu,
giảm huyết cầu tố.
- Ngoài ra, vàng da ứ mật, tăng K
+
huyết, ù tai, ảo giác. Tiêm tĩnh mạch
có thể gây viêm tĩnh mạch, tổn thương mô.
.
7

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL
[3], [4], [11], [12], [13], [24], [25].

nước thải bệnh viện tương đối thấp nên các phương pháp trên không đáp ứng
được yêu cầu. Chính vì thế, cần sử dụng LC-MS với độ nhạy cao hơn để định
lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện.

.
8

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [1], [8], [15].
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết
nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS). Sau
quá trình thử nghiệm lâu dài, đến đầu những năm 1970 người ta mới kết nối
thành công hệ thống LC với MS. Nguyên nhân của sự chậm trễ này chủ yếu là
do khó khăn về kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân
không cao của máy khối phổ (MS). Kể từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ
LC-MS không ngừng phát triển và chứng minh được tầm quan trọng của
mình trong phân tích.
Phương pháp LC-MS thường được sử dụng trong phân tích dược phẩm
để phân tích:
- Các hợp chất tương đối phân cực hoặc phân cực nhiều, khó bay hơi (GC-
MS rất khó thực hiện hay không thực hiện được).
- Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC thường không giải quyết
được.
- Phân tích thuốc trong dịch sinh học.
- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc.
- Trường hợp không tìm được các detector thích hợp.
Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Giới hạn
phát hiện có thể đến 10
-14
gam. Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị,

+ Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng liên tục qua cột tách. Dòng
không liên tục sẽ gây nhiễu đường nền.
+ Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn). .
10

1.3.1.3. Hệ tiêm mẫu:
Hiện nay, các máy HPLC hiện đại đều sử dụng hệ thống tiêm mẫu tự
động. Đây là một ưu điểm lớn của HPLC vì có thể tích chính xác và độ lặp lại
rất cao.
1.3.1.4. Cột sắc ký.
Cột tách thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất
dẻo có chiều dài từ 10 - 30 cm, đường kính trong 4 - 10 mm. Kích thước của
hạt nhồi trong cột thường là 5 - 10 µm. Các chất nhồi cột thường được sử
dụng là silicagel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C8,
C18,
Cột tách yêu cầu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có
thể chịu được áp suất cao.
1.3.1.5. Detector khối phổ.
Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột,
các tín hiệu này được ghi trên sắc đồ.
 Việc sử dụng khối phổ làm detector có những ưu điểm sau:
- Độ nhạy cao, phân tích được các chất có giới hạn phát hiện thường ở mức
phần tỷ (ppb).
- Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về khối lượng và cấu tạo hóa học
của chất phân tích.
- Làm tăng tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích.
 Nguyên tắc hoạt động:

Hình 01 : Các bộ phận của detector khối phổ
 Bộ nạp mẫu: Là đầu ra của máy sắc ký lỏng kết nối với khối phổ.
 Bộ nguồn ion hóa:
• Nhiệm vụ:
- Ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu.
- Ion hóa chất cần phân tích.
- Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi.
- Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối.
- Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân
không sâu.
- Rút ra ngoài các phân tử trung hòa và ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới
phép đo.

Nạp mẫu
Nguồn
ion
Phân tích
khối
Detector
Bơm chân
không

Xử lý dữ
liệu

.
12

• Các kỹ thuật ion hóa:
Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật: Kỹ thuật phun điện tử (ESI) và

O + H
2
O
+
→ H
3
O
+
+
∙
OH (Phản ứng ion- phân tử)

M + H
3
O
+
→ MH
+
+ HO (Phản ứng ion- phân tử)
+ Cơ chế tạo ion âm:
Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện có sự ion hóa
của phân tử bằng cách mất đi một H
+
, phần còn lại là một anion:

∙
OH + M-H

→ M
-


 Bộ phân tích khối:
Bộ phận này được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách
các ion của máy có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Các ion
được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến
detector.
Bộ phân tích khối trong luận văn này là bộ phân tích bẫy ion tứ cực
(Quadrupole ion trap).
Thế xoay chiều tần số radio áp vào cực trung tâm sẽ đưa các ion vào
chuyển động tròn trong hốc với quĩ đạo ổn định. Bằng cách thay đổi thế xoay
chiều làm cho các ion có m/z xác định chuyển động theo quĩ đạo không ổn
định rơi vào cực phía dưới bẫy. Bộ phận nhận electron của detector sẽ thu
nhận và phát hiện ion.
Hình 04: Sơ đồ bộ phân tích ion bẫy tứ cực.

.
15

Bộ phân tích tứ cực đơn.
Bộ phân tích từ.