BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ñó
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
HYDROGEN PEROXIDE CỦA CAO CHIẾT
LÁ CÂY SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb)
IN VITRO
Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG TRƯƠNG THỊ NGỌC TUYỀN
BỘ MÔN SINH HỌC MSSV: 3102707
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỚP: SINH HỌC K36
Cần Thơ, Tháng 11/2013
i
LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp là một bài học to lớn cũng như một thành quả đầu tiên của
thời sinh viên. Thành quả này góp một phần không nhỏ trong hành trang vào cuộc
sống đối với sinh viên nói chung và sinh viên ngành Sinh Học nói riêng. Tất cả
những điều tôi học được từ luận văn trên giúp tôi trau dồi thêm những kiến thức đã
học, kèm theo nhiều kinh nghiệm qu
ý báu có thể cho tôi khả năng định hướng tốt và
vững vàng cho những công việc thuộc chuyên ngành trong tương lai.
Trong quá trình làm luận văn tôi cũng gặp không ít khó khăn. Tuy nhiên, nhờ
có sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp tôi vượt qua.
Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Cô TS. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn
.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến quí Thầy Cô Bộ môn Sinh học - Khoa
Khoa Học Tự Nhiên đã cho tôi nền tảng kiến thức để tôi có thể học hỏi và trao dồi
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
iv
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Str
ess oxy hóa và gốc tự do 3
2.1.1. Stress oxy hóa 3
2.1.2. Gốc tự do 3
2.2. Chất chống oxy hóa 4
2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên 6
2.3.1. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong nước 6
2.3.1.1. Các hợp chất phenol 6
2.3.1.2. Vitamine C 7
2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo 8
2.3.2.1 Các carotenoid 8
2.3.2.2. Vitamine E 9
2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H
2
O
2

4.1.1. Độ ẩm của lá Sa Kê 18
4.1.2. Hiệu suất tạo cao chiết 19
4.2. Khảo sát hoạt động phân hủy gốc Hydrogen Peroxyde (H
2
O
2
) (Hydrogen
Peroxyde Scavenging Activity (HPSA) assay)
in vitro của cao chiết lá cây Sa Kê
19
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25
5.1. Kết luận 25
5.2. Kiến nghị 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Lá Sa Kê dùng trong thí nghiệm 17
Hình 4.2
Đường chuẩn khảo sát khả năng phân hủy H
2
O
2
in vitro của
Trolox 20
Hình 4.3
Phần trăm lượng Hydrogen Peroxyde (H
2
O
2
) còn lại sau phản

hái quanh năm. Chính vì vậy việc nghiên cứu một cách chuyên sâu về các tác dụng
dược l
ý để tăng giá trị sử dụng của loài cây này là cần thiết. Đề tài này được tiến
hành nhằm xác định khả năng phân hủy gốc tự do Hydrogen per
oxyde (H
2
O
2
) của
cao chiết lá
cây Sa Kê in vitro. Sự phân hủy gốc tự do của cao chiết được đo lường
thông qua khả năng hoạt động phân hủy gốc Hydrogen per
oxyde (Hydrogen
Peroxyde Scavenging Activity,
HPSA). Kết quả của nghiên cứu cho thấy cao chiết
lá Sa Kê có khả năng chống
oxy hóa dựa trên khả năng phân hủy H
2
O
2
. Khả năng
phân hủy gốc
H
2
O
2
của cao chiết tăng dần ở các nồng độ khảo sát 12,5; 25; 50; 100;
200; 400; 600; 800; 1000; 1200 và 1400 µg/ml.
Vì vậy, kết quả thí nghiệm chứng
minh cao chiết lá Sa Kê có khả năng phân hủy H

kiện sinh thái rộng, ít bị sâu bệnh (Ragone, 1997, 2006). Đặc biệt,
lá Sa Kê còn
dùng được để chữa một số bệnh như gãy xương, bong gân, giảm đau thần kinh
hông, bệnh do nấm gây ra như bệnh tưa miệng (thrush), tiêu chảy, đau dạ dày và
lỵ, giúp giảm huyết áp
(Ragone, 2006). Vì vậy, ngày nay ở nước ta Sa Kê được
trồng rộng rãi, vừa làm thực phẩm, vừa làm cảnh
trong vườn nhà, các cơ quan,
đường phố, hoặc công viên và dùng chữa các bệnh.
Trong dân gian lá Sa Kê
được dùng để chữa phù thủng, viêm gan vàng da bằng cách nấu lá tươi để uống.
Việc việc chứng minh một cách khoa học về hiệu quả của các bài thuốc
chữa bệnh bằng lá Sa Kê trong dân gian là cần thiết
, từ đó có thể làm phong phú
hơn nguồn dược liệu
trong nước và thế giới.
Đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY H
2
O
2
CỦA CAO
CHIẾT LÁ
SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) IN VITRO” được thực
hiện nhằm đánh giá khả năng phân hủy H
2
O
2
ở mức độ in vitro trong việc giảm
bớt lượng gốc tự do tích tụ trong cơ thể mà gốc
H

Stress oxy hóa (oxydative stress) là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
chống
oxy hóa và các chất oxy hóa trong cơ thể theo hướng tạo ra nhiều các chất
oxy hóa (Katalinic et al., 2006). Stress oxy hóa là kết quả của sự hình thành gốc
tự do vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể. Điều
này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ để trung
hòa các gốc tự do. Kết quả các gốc tự do sẽ tấn công các phân tử lipid, protein,
acid nucleic của tế bào dẫn đến tổn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự
hoạt động bất thường của cơ quan (Meister, 1992). Stress oxy hóa là nguyên
nhân gây ra sự phát triển của ung thư, lão hóa, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer,
xơ vữa động mạch , suy tim, nhồi máu cơ tim, tiểu đường, gout,…(Halliwell,
2007; Valko et al, 2007; Singh et al, 1995).
2.1.2. Gốc tự do
Các gốc tự do là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen
Species – ROS và Reactive Nitrogen Species –
RNS) là các dẫn xuất dạng khử
của
oxy và nitơ phân tử. Gốc tự do là tất cả các phân tử hóa học chỉ có một điện
tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ. Do các phân tử mang điện
tử lẻ không cân bằng, không bền vững, dễ tạo ra phản ứng. Các phân tử mang
điện tử lẻ luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác,
và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới (Pal
et al., 2011). Gốc tự do
được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và dẫn xuất không phải gốc tự
do (Bảng
2.1). Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều
điện tử đơn lẻ. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như
oxy đơn, hydroperoxyde,
nitroperoxy
de là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS và RNS phản ứng rất

H
2
O
2
1
O
2
NO
o
ONOO-
HOCl
Gốc superxyde
Gốc hydr
oxyl
Gốc peroxyde
Hydrogenperoxyde
Oxy
đơn
Oxyde nitrice
Peroxynitrite
Acid hypochlorique
2.2. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc
đảo ngược quá trình
oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic
và Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh và Rajini, 2004). Có nhiều cách
phân loại chất chống
oxy hóa, dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy
hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống
oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc

2
Glutathion peroxydase (tế bào)
Phân giải hydrogen peroxyde và
hydroperoxy
de của acid béo tự do
2 H
2
O
2
+ 2 GSH → 2 H
2
O + GSSG
LOOH + 2
GSH → LOH + H
2
O +GSSG
Glutathion peroxydase (huyết tương)
Phân giải hydrogen per
oxyde và
hydroperoxy
de của phospholipide
2 H
2
O
2
+ 2 GSH → 2 H
2
O + GSSG
PLOOH +
2GSH → PLOH+H

Biến đổi ion superoxyde
2 O°
-
2
+ 2 H
+
→ 2 H
2
O + O
2
Hệ thống các chất chống oxy hóa ở cơ thể người có nguồn gốc nội sinh và
ngoại sinh. Các chất chống
oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine,
transferrine, albumine, protein
sốc nhiệt - heat shock protein) và các enzyme
chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase). Các chất
chống
oxy hóa ngoại sinh là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường
thức ăn bao gồm vitamine E, vitamine C các carotenoid và các hợp chất phenolic.
Các chất này có nhiều trong rau, quả và được xem là các chất chống oxy hóa tự
nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để
tăng cường hoạt động của hệ thống chống
oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có
nguồn gốc stress
oxy hóa (Niki et al., 1995; Pincemail et al., 1998; Lachman et
al
., 2000; Vansant et al., 2004).
2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên
2.3.1. Các chất chống
oxy hóa hòa tan trong nước

6
-C
2
-C
6
) và lignine (C
6
-C
2
)
n
. Cấu trúc của các
hợp chất phenol quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa (Scalbert và
Wiliamson, 2000)
. Các cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol bao gồm
khử và gây bất hoạt các gốc tự do nhờ thế
oxy hóa khử thấp; tạo phức với các ion
Fe
2+
và Cu
+
; kìm hãm hoạt động của các enzyme có khả năng tạo các gốc tự do
như xanthine
oxydase (Jovanovic và Simic ,2000).
Hoạt động của xanthine oxydase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do. Khi
có mặt của
oxy, enzyme này xúc tác sự oxy hóa xanthine thành acid uric, phân tử
oxy nhận điện tử và trở thành ion superoxyde.
Các flavanoid có cấu tạo vòng giống như vòng purin của xanthine được
xem như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxydase do đó ngăn ngừa sự tạo

2
O Acid uric + 2O
2
-
+ 2H
+
Xantine oxydase
8
nguyên dạng, sẵn sàng gây bất hoạt các gốc tự do peroxyde mới. Các carotenoid
và các flavonoid khi gây bất hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ
chế tương tự bởi vitamine C. Điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt
oxy hóa
(pro-oxy
dante) của các gốc vitamine E và flavonoid (Jovanovic và Simic, 2000;
Burke
et al., 2001).
2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo
2.3.2.1 Các carotenoid
Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh
vật có khả năng quang hợp. Carotenoid đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật
đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trò là sắc tố phụ. Về mặt cấu tạo,
các carotenoid thường chứa một mạch carbon dài (35
– 40 carbon) mang nhiều
nối đôi, kết thúc bởi một cấu trúc vòng hoặc không; tùy thuộc vào sự có mặt hay
không của nhóm hydr
oxyl ở cấu trúc vòng mà các carotenoid được chia thành
caroten và xanthophylle. Đối với con người, các carotenoid là các chất chống oxy
hóa quan trọng vì nó có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả
năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi rất dễ xảy ra sự
oxy hóa và gây

năng gây bất hoạt
oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998) bởi một cơ chế vật lí.
Năng lượng dư của oxy đơn được chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái
bình thường trong khi carotenoid được chuyển lên trạng thái kích thích. Các
carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thường bằng cách phát ra môi
trường năng lượng dư thừa mà nó nhận được từ
oxy đơn. Khả năng gây bất hoạt
oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C. Mỗi phân
tử carotenoid có khả năng gây bất hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia
vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác
(Krinsky,
1998).
Ngoài khả năng gây bất hoạt oxy đơn, các carotenoid còn gây bất hoạt các
gốc tự do bằng cách kết hợp các gốc này theo một trong các cơ chế: (1) chuyển
điện tử: Car + ROO → Car
+
+ ROO- ; (2) chuyển hydro: Car + ROO → Car
+
+
ROOH
; (3) cộng hợp: Car + ROO → ROOCar (với Car: carotenoid) (Britton,
1995; Mortensen
et al., 2001; El-Agamey et al., 2004).
Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy
hóa khác. Các gốc tocopheryl được khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ
nhận được hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid
(Niki et al., 1995; Stahl và Sies, 2003). Thay vì bị thải ra ngoài qua con đường
nước tiểu như polyphenol và vitamine C
(Jovanovic và Simic, 2000; Tapiero et
al

oxyl càng bị cản trở ít (trường hợp δ-tocopherol và δ-
tocotrienol),
khả năng chống oxy hóa càng cao (Huang et al., 2002).
2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H
2
O
2
)
Hydrogen peroxyde là một chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng có vị
đắng. Một lượng nhỏ khí hydrogen
peroxyde xảy ra tự nhiên trong không khí.
Hydrogen peroxyde là chất không ổn định, dễ dàng phân hủy thành oxy và nước,
sinh nhiệt (ATSDR, 2002).
Hydrogen peroxyde (H
2
O
2
) có vai trò tích cực trong sản xuất năng lượng
trong hệ thống cơ thể, thực bào, chuyển tín hiệu tế bào, điều chỉnh tăng trưởng tế
bào và tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng (Packer
et al., 2008).
Tuy nhiên, ở nồng độ cao các hydrogen peroxyde (H
2
O
2
) góp phần làm
thay đổi cấu trúc DNA,
oxy hóa lipid là nguyên nhân gián tiếp gây ra các căn
bệnh nguy hiểm như ung thư, gout, tiểu đường, suy tim
(Pincemail et al., 1998;

2.6. Giới thiệu về cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg)
2.6.1. P
hân loại
Sa Kê là loài cây nhiệt đới thuộc chi Artocarpus, họ Moraceae (dâu
tằm/sung) (Jarrett, 1959; Fosberg, 1960). Tên gọi “Sa Kê” là để chỉ loài
Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, nhưng đôi khi cũng được dùng khi nói
đến
A. camansi hoặc A. mariannensis. Artocarpus altilis được phân loại như loài
cây được thuần hóa, không tìm thấy ở dạng hoang dại, được thuần hóa từ
breadnut - A. camansi (Zerega et al., 2004, 2005).
Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), cây Sa Kê được phân loại như sau:
Ngành: Angiospermae
Lớp: Eudicots
Bộ: Rosales
Họ: Moraceae
Giống: Artocarpus
Loài:
A.altilis
Cây sakê còn có tên gọi là cây bánh mì. Tên khoa học là Artocarpus altilis
(Park) Forb
.
2.6.2. Nguồn gốc
Sa Kê phân bố rộng rãi khắp Thái Bình Dương và có sự thích nghi khá tốt
về
hình thái theo từng vùng miền, từ những loại trái không hạt đến những loại
nhiều hạt
(Ragone, 2006).
12
Gần một thế kỷ qua các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về nguồn gốc
của Sa Kê, tuy nhiên chưa có một giả thiết nào có khả năng thuyết phục cao cho

đực có một tiểu nhụy. Cụm hoa cái cho ra hợp giả quả gần như tròn, có u nhọn,
to khoảng 20 cm, xanh nhạt và hơi
vàng, nạc trắng, không ngọt, chứa nhiều hột,
to 1 cm (var. seninifera), hay thường vắng (var. apyrena).
Sa Kê là cây l
ưỡng tính, cụm hoa gồm 1500-2000 hoa nhỏ gắn với đế hoa.
Cụm hoa đực kéo dài và có hình gậy tày, dài 12
,5-30 cm (Morton, 1987). Cụm
hoa cái hình cầu và phát triển thành hợp giả quả (Jarrett, 1976). Cụm hoa đực
xuất hiện sớm hơn cụm hoa cái để tránh hiện tượng tự thụ (Heard
, 1999). Cụm
13
hoa đực ở những cây có hạt cho nhiều hạt phấn có sức sống, ngược lại ở những
cây có ít hoặc không hạt thì cho ít hoặc không có hạt phấn có sức sống (Sunarto,
1981). Sự phát triển trái ở
Sa Kê không hạt đã được chứng minh rằng không cần
hạt phấn (Hasan và Razak, 1992). Các cây không hạt thường thiếu noãn phát
triển hoặc có nhiều noãn nhỏ bị chết. Khi cụm hoa cái phát triển, bao hoa của
từng hoa mở rộng và tạo thành phần tinh bột ăn được của quả.
Hình thái trái có sự đa dạng lớn về kích thước, hình dạng và những thuộc
tính khác. Thông thường, trái có dạng tròn, oval hoặc thuôn, dài khoảng 12 cm,
rộng 12
-20 cm và nặng 1-2 kg, nhưng đôi khi có thể lên đến 6 kg (Ragone,
1996
). Vỏ cũng biến đổi về màu sắc từ xanh sang đến vàng khi chín, một giống
khác thường (‘Afara’ từ French Polynesia) có vỏ màu hồng nhạt và cam nâu. Thịt
quả từ trắng kem đến vàng. Các phần nhỏ trên bề mặt trái có thể tương đối phẳng
hoặc hình nón nhô lên 5 mm. Do đó, trái có thể nhẵn, xù xì hoặc có gai (
Zerega
et al., 2005; Ragone, 2006a). Nhiều giống A. altilis là tam bội, cho trái không hạt

cho rằng chiết xuất từ các dung môi khác nhau của Artocarpus altilis (nước,
methanol, ethanol, acetone) cho thấy hàm lượng flavanoid và các chất chống oxy
hóa khá cao. Vì vậy, nghiên cứu này đã làm sáng tỏ khả năng chống oxy hóa tiềm
năng của một loại trái cây không được tận dụng như Artocarpus altilis.
Một nghiên cứu về Artocarpus altilis của Tare et al. (2012) khẳng định rằng
cành và lá của loài này có chứa nhiều chất chống oxy hóa, đặc biệt là thành phần
flavonoid phong phú, các flavonoid thu được bằng cách chiết xuất DCM
(dichloromethane) trong khi saponin được tìm thấy phong phú trong chiết xuất
methanol. Điều này cho thấy Artocarpus altilis là một tiềm năng đầy hứa hẹn sẽ
được sử dụng như chất chống oxy hóa và nguồn để trị bệnh khác nhau.
15
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện
:
Phòng thí nghiệm Sinh Học, Bộ môn Sinh, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại
Học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân tử, Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học,
Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Eppendorf 1,5 ml và 2 ml, micropipette (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl), đầu
cone (vàng 100 µl, xanh 1000 µl), chai thủy tinh (50 ml, 250 ml, 1000 ml), cốc
thủy tinh (40 ml, 1000 ml), ống đong (10 ml, 1000 ml), kim mũi giáo, găng tay,
giấy bạc.
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm
máy cô quay (Evaporate),
máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), cân phân tích AB104-S, máy
đo pH Metler Toledo, máy trộn mẫu Vortex, máy khuấy từ.