i

LI CM N
u tiên, con xin cm n ba má đư sinh con ra, dy d, nuôi nng cho con n hc nên
ngi
K đn, em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c thy cô trong khoa Công ngh sinh
hc đư truyn đt cho em kin thc trong sut quá trình hc tp.
Em xin gi li cm n sơu sc đn cô Lê Th Kính đư hng dn em thc hin đ tài.
Em cm n anh Hi, ch Trang, anh Khánh cng nh các ch trong t Nuôi Cy Mô ca
Trung Tâm Nghiên Cu Ging Cây Trng Min Nam đư luôn giúp đ em trong thi
gian qua.

ii

Mc lc
I. TNG QUAN 1
1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1
1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii 1
1.1.2. Tình hình nuôi cy bao phn  Vit Nam 4

III.1 Kho sát kh nng to mô so ca mt s kiu gen (thí nghim 1). 26
III.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 28
III.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 34
IV. KT LUN VÀ  NGH 40
IV.1 Kt lun 40
IV.2  ngh 40
iv

Mc lc Hình nh, Bng và Biu đ
Hình 1: Chiu dƠi đng lúa cn thu khong 20 cm 24
Hình 2: V trí ly bông lúa t đng lúa 24
Hình 3: Gié lúa thích hp cho nuôi cy bao phn (A), bao phn tách ri (B) (3x) 25
Hình 4: on bông lúa chun b đem cy bao phn 25
Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26
Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái sinh MS
28
Hình 7: Quá trình phát trin mô so ca t hp lai LL5 29
Hình 10: Mô so cht (t hp lai LL3) 32

Hình 11: Cây bch tng ậ LL5 (2 tun tui) 33
Hình 12: Cơy bình thng ậ LL5 (2 tun tui) 33

Hình 13: Cây bch tng ậLL5 (1 tháng tui) 34
Hình 14: Cơy bình thng ậ LL5 (1 tháng tui) 34

vi

T VN 
Cây lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy lng thc gi vai trò quan trng hƠng đu. Mi
nm, khong 1/2 dân s th gii s dng lúa go lƠm lng thc chính. Lúa đc trng
ph bin  các nc Châu Á, Châu Phi, Châu M La Tinh. i vi các nc Chơu nh:
n , Trung Quc, Indonesia, Bangladesh, Myanmar, Thái Lan và Vit Nam thì lúa
go lƠ cơy lng thc đc bit quan trng trong đi sng con ngi.
Trong nhng nm gn đơy, cùng vi đƠ tng dơn s, s phát trin mnh m ca
nn công nghip vƠ đô th hoá nông thôn làm cho din tích đt trng trt ngày càng thu
hp li.  đáp ng đ nhu cu lúa go ca ngi tiêu dùng vƠ an ninh lng thc quc
gia, các nhà to ging phi tìm cách lƠm tng nng sut, sn lng lúa trên din tích đt
trng không th m rng. Phng án s dng các bin pháp k thut thâm canh trên
nhng ging lúa cao sn, chu thâm canh là thích hp nht.
Bng phng pháp lai to truyn thng
các nhà to ging đư có nhiu thành công
vi nhng ging mi có nng sut và sn lng cao. Song vic s dng phng pháp
này tuy có to ra nhng t hp lai nng sut cao nhng đ thun cha n đnh. Mt
khác, nu áp dng phng pháp lai to truyn thng thì phi mt khong 10 v (4-5
nm) mi có đc dòng thun. Trong nhng nm gn đơy, vic ng dng bin pháp
nuôi cy bao phn to các dòng đn bi kép, nhanh chóng to các ging lúa thun có
nng sut cao, chng chu tt, đư thu đc nhiu kt qu. ó lƠ phng pháp to dòng
thun nhanh (1 nm) và hiu qu nht.
 thành công trong vic to các dòng thun bng k thut nuôi cy chúng ta
phi xác đnh đc nhng yu t v kiu gen, môi trng dinh dng, các tác nhân vt
lý, hoá hc… Trong đó, kiu gen là yu t đc nhiu nhà khoa hc đt lên hƠng đu
(Sharmin S. 2003, Sharmin S.2004) do nó nh hng rt ln đn kh nng to mô so

thy s khác bit ca các kiu gen kéo theo s khác bit trong kh nng nuôi cy lúa.
Kiu gen loài ph Indica phát trin và to mô so kém so vi loài ph Japonica.
Theo Mathias và Fukki (1986) kh nng tái sinh ca cây lúa trong nuôi cy t
bào b chi phi bi s tng tác t bào cht, nhân ca chính nó.
* nh hng ca giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu
Các tác gi Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thy: mu bao phn đc ly
vào thi đim các tiu bào t trong bao phn đang  giai đon đn bƠo mun là tt
nht. Bao phn  giai đon t th không có kh nng phát trin trong môi trng nuôi
cy in vitro, Bao phn  giai đon đn bƠo sm phát trin kém.
2

Ht phn ch có th phát trin tt khi đư tách ra khi t t (giai đon đn bƠo gia đn
đn bƠo mun).
*nh hng ca nhit đ và thi gian x lý đòng
Kêt qu nghiên cu ca Zhou vƠ Cs (1983) đư cho thy rng: X lỦ đòng 
nhit đ thp rt có hiu qu trong nuôi cy bao phn lúa. iu kin lnh lƠm tng kh
nng to cây xanh.
 Chaleff và Cs (1975) x lỦ đòng  6
o
C trong 5 ngày
 Hu vƠ Cs (1978) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10
0
C trong thi gian 4 - 8 ngày.
 Matitin vƠ Drimo Millo (1981) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 2 ậ 4
o
C
trong thi gian 48h.
 Gupta vƠ Borthakeu (1987) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10
0
C trong thi gian

Nm 1980, Khi nuôi cy bao phn lúa Japonica, Yang và cng s đư s dng kt hp
NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l . Kt qu cho thy rng nu
môi trng to mô so có cha 2,4D nng đ 1mg/l thì mô so d dàng tái sinh thành
cây.
Theo Wasakd (1982): IAA xúc tin quá trình hình thành r, S kt hp các
auxin: IAA, NAA, Kinetin mt cách hp lý s xúc tin mnh m quá trình phân hoá t
bào và tái sinh cây xanh.
Nhìn chung, các cht tham gia vào môi trng nuôi cy bao phn lúa nh cht
điu hoà sinh trng, mui, đng, st, Vitamin đu có s nh hng ln nhau và
nh hng chung đn kt qu ca quá trình nuôi cy.
* nh hng ca các yu t vt lý trong môi trng
Các yu t vt lý ca môi trng bao gm:
 Trng thái vt lý ca môi trng  dng rn hay lng
  pH môi trng
  m không khí
 Ánh sáng và nhit đ ca phòng nuôi cy
Các yu t trên tác dng trc tip đn s hình thành mô so và kh nng tái sinh
chi.
Kt qu nghiên cu lúa mì ca Bjarmsta (1989) cho thy rng x lý ánh sáng
cng đ cao s kìm hãm quá trình to mô so nhng li kích thích quá trình to cây
4

xanh, ánh sáng yu hoc ánh sáng khuych tán không nh hng gì đn kh nng to
mô so ca mu cy.
* nh hng ca các môi trng khác nhau đn quá trình nuôi cy bao phn.
Các môi trng khác nhau s cho nhng kt qu nuôi cy bao phn là khác
nhau. Nm 1962 Dono thông báo môi trng MS là môi trng thích hp nht cho
nuôi cy bao phn. n nm 1975 thì Chu vƠ cng s li thông báo rng môi trng
N6 là môi trng tt nht cho nuôi cy bao phn lúa.
Nm 1974, hai nhóm nghiên cu ca Chen vƠ Wang đư thƠnh công ln khi s

bi.
-  loi b các nhân t cnh tranh đi vi s phát trin ca ht phn, các nhà
nghiên cu đư tin hành nuôi ht phn ht phn sau khi đư tách ri khi mô túi
phn. Song kt qu đt đc vn còn rt khiêm tn. Thc t cho thy t l mô
so hình thành thp, sc tái sinh cây t mô so cng không cao.
Cng trong thi gian này, các tác gi đư th nghim nuôi cy bao phn lúa trong
môi trng lng và rút ra kt lun:
 Môi trng lng thun li cho s hp thu dinh dng hn môi trng rn.
 Các cht đc do ht phn cht to ra không có tác đng xu ti các ht phn
khác bi vì nó đư b khuch tán vào môi trng lng.
Nm 1994, Vin di truyn nông nghip công b quá trình nuôi cy bao phn,
nâng cao t l to mô so và kh nng tái sinh ca cơy đn bi (Nguyn Vn ng, V
c Quang, Phm Ngc Lng, Trn Duy Quý 1994).
T nm 1994 ậ 2001, đư có công trình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa mi đ
chn to ngun vt liu khi đu phc v phát trin lúa lai đc công b (Vin di
truyn nng nghip 1997 - 2000).
6

Các nhà khoa hc Vit Nam đư đt đc mt s thành tu có Ủ ngha to ln
trong sn xut. Ti vin Di Truyn Nông nghip, phng pháp nuôi cy bao phn kt
hp vi chn dòng bin d đư to ra 50 dòng bt dc phn ng vi nhit đ mi , trong
đó 5 dòng đc xác đnh là có tính bt dc n đnh, có u th lai cao khi lai to vƠ đang
đc s dng trong chn ging lúa lai 2 dòng.
Bng phng pháp nuôi cy bao phn đư to ra 12 dòng, ging thun có u th
lai gn tng đng vi con lai F1 các dòng ging có trin vng gm DT26, DT29,
DT32, AC22, AC23, AC24, AC25, đang đc kho nghim. Nh nuôi cy bao phn
lúa có th rút ngn thi gian chn ging mi xung t 4-6 th h. K thut đn bi in
vitro cng đang đc trin khai mnh trong chn ging  Vin lúa ng bng sông
Cu Long, Vin công ngh sinh hc (Trn Vn Minh, 1997).
Nhng nm gn đơy, V c Quang và cng s đư tin hành nghiên cu và ci

S phân hoá t bào là s chuyn các t bào phôi sinh thành các t bào ca mô
chuyn hoá, đm nhn các chc nng khác nhau trong c th. Quá trình phân hoá ca
t bào có th biu th nh sau:
T bào phôi sinh T bào giãn T bào chuyên hoá chc nng
riêng
Mc dù các t bƠo đư chuyn hoá thành các mô chc nng nhng chúng vn gi
nguyên kh nng phơn chia. Trong điu kin thích hp, các t bào li có th tr v dng
t bào phôi sinh và phân chia mnh m. Quá trình đó đc gi là phn phân hoá t bào,
(ngc li vi quá trình phân hoá t bào). Tuy nhiên, khi t bào đư phơn hoá thƠnh các
t bào có chc nng chuyên bit, chúng không hoàn toàn mt kh nng bin đi ca
mình. Trong điu kin cn thit  điu kin thích hp, chúng li có th tr v dng t
bào phôi sinh và phân chia mnh m. Quá trình đó gi là phn phân hoá t bào, ngc
li vi quá trình phân hoá t bào.
8

Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cy mô, t bào thc vt thc
cht là kt qu ca quá trình phân hóa và phn phân hóa t bào. K thut nuôi cy mô,
t bào xét cho cùng là k thut điu khin s phát sinh hình thái ca t bào thc vt
mt cách đnh hng da vào s phân hóa và phn phân hóa ca t bƠo trên c s tính
toƠn nng ca t bào thc vt.  điu khin s phát sinh hình thái ca mô nuôi cy,
ngi ta thng b sung vào môi trng nuôi cy 2 nhóm cht điu tit sinh trng
thc vt là auxin và cytokinin. Nu t l auxin/cytokinin thp thì s phát sinh hình thái
theo hng to chi; nu t l này cao thì to thành r, còn khi t l này cân bng thì s
phát sinh theo hng to mô so (Lê Trn Bình, 2004).
1.2.3. C ch di truyn thông qua các th h t bào
C ch di truyn thông qua các th h t bào bao gm các công đon:
Trong quá trình nguyên phân, t mt t bào m s nhơn đôi, to ra 2 t bào con
ging nhau và ging t bào m ban đu. Nh vy qua nguyên phân b NST trong ni
b tng c th đc din ra theo c ch nguyên phơn, đơy lƠ c ch phân bào mà t
mt t bƠo ban đu s phân chia thành hai t bào con có b NST ging b NST ca t

s cht ph gia. Thành phn dinh dng, hàm lng các cht cn thit cho t bào sinh
trng tt nht thay đi tu theo tng loài, ging, ngun gc mu cy hay tng c quan
khác nhau trên cùng mt c th.
1.2.4.2. Mt s môi trng c bn
ư có rt nhiu môi trng dinh dng ln lt đc tìm ra trên c s ci tin
môi trng ca Kotte và Robbin (1902) nh: Môi trng White (1934), Knudson
(1946), Vacin và Went (1949), Heller(1953), Murasnige - Skoog (1962), Gammborg
(B5) (1968), Knop (1974), WMR (1982), Aderson (1984),… Tuy nhiên, mi môi
trng ch thích hp vi mt loài cây nht đnh nh: Môi trng Knudson (1946),
Vacin và Went (1949), ch thích hp cho các loài Lan, môi trng MS thích hp cho
10

các loài cây thân tho và mt s loài cây thân g sinh trng nhanh nh Keo, Bch
đƠn…Môi trng WMP ch thích hp cho các loài cây thân g (Trn Vn Minh, 1997).
Tu thuc vào tng đi tng c th, trong mi giai đon nuôi cy, mà la chn
loi môi trng thích hp thì mi có kt qu kh quan. Thông thng, ngi ta hay s
dng môi trng H5 và môi trng N6 cho nuôi cy bao phn lúa (Sharmin S., 2004)
1.2.5. iu kin vô trùng
Nuôi cy in vitro là nuôi cy trong điu kin vô trùng. Nu không đm bo tt
điu kin vô trùng mu nuôi cy hoc môi trng s b nhim, mô nuôi cy s b cht.
iu kin vô trùng có Ủ ngha quyt đnh đn s thành bi ca ca nuôi cy mô in vitro
(Nguyn Quan Thch, 2005)
Phng pháp vô trùng vt liu thông dng nht hin nay là dùng các cht hóa hc, tia
cc tím có kh nng dit nm và vi khun.
Vô trùng ban đu là mt thao tác khó vƠ lƠ khơu đu tiên có Ủ ngha quyt đnh.
Tuy vy, nu tìm đc nng đ và thi gian x lý thích hp s cho t l sng cao,
thông thng hay s dng mt s hóa cht nh HgCl
2
0.1%, NaHCl 10%, nc javen,
cn 76

0
C (white, 1973).

1.2.7. Vt liu nuôi cy
 bt đu quá trình nhân ging vô tính cho 1 loài hoc 1 dòng ngi ta phi
chú trng trc nht là vt liu nuôi cy. ơy lƠ bc đu tiên và là khâu quan trng
quyt đnh đn s thành bi và tc đ sinh trng ca quá trình nhân ging. Theo
nguyên tc, bt k mt t bƠo trong c th đu có kh nng tái sinh thƠnh mt cây hoàn
chnh trong điu kin thích hp. Tuy vy đ có tc đ tái sinh, sc sng, sc chng
chu ca cây con cao thì kh nng đó còn tùy thuc vào tui sinh lý ca vt liu nuôi
cy (Nguyn c Thành, 2000)
Trong nuôi cy mô ngi ta thng s dng vt liu nuôi cy nh đnh sinh
trng, chi, bao phn, gieo qua ht, thân mm….
12

1.3. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy bao phn lúa
1.3.1. Kiu gen ca cây cho bao phn
Kiu gen ca cây cho bao phn nuôi cy có nh hng rt ln đn kt qu nuôi
cy. Nuôi cy bao phn ca các ging lúa thuc loài ph Japonica (k c trng hp
không x lý lnh trc) đu đt t l thành cây thng cao hn nuôi cy bao phn ca
các ging lúa thuc loài ph Indica. Chen và Lin (1981) còn thy rng t l bao phn
to callus, kh nng callus tái sinh thƠnh cơy, t l cây xanh/cây bch tng và s lng
nhim sc th ca cơy tái sinh đu liên quan đn kiu gen ca cây cho bao phn. iu
này chng t kh nng nuôi cy bao phn lúa cng do gen điu khin, đi vi nhng
ging phn ng tt có th cha nhiu gen tác đng lên quá trình này.
 tng hiu qu nuôi cy có th bng cách lai to nhm ci tin ging. Ví d :
 khoai tây kiu gen phn ng tt có th thu đc bng cách lai gia kiu gen phn ng
kém vi kiu gen phn ng tt.
Phi thay đi điu kin và môi trng nuôi cy cho tng loi cây trng thm chí
cho tng ging cây trong cùng mt loài.

o
C
trong 10-14 ngày (Nguyn c Thành, 2000)
Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hin ra rng nhng ht phn
đc x lý lnh đt ngt  8-10
o
C trong 7 ngày to ra nhiu callus hn gp 2 ln so vi
không x lý. Tuy nhiên kt qu không khác bit khi x lý lnh bao phn đư cy trên
môi trng.
Theo Chen và C.s (1982), thi gian x lý lnh dài 8-10 ngày tt hn 2-4 ngày.
Tuy nhiên nu kéo dài thi gian này quá 15 ngày li c ch quá trình hình thành callus.
14

Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho bit callus hình thành t bao phn đc x
lý lnh s to ra nhiu cơy đn bi và ít cây lng bi hn lƠ t bao phn không x lý,
điu kin lnh đư kích thích vic to callus sm và kh nng tái sinh thƠnh cơy cao.
Các ging khác nhau đòi hi điu kin x lý khác nhau, trng thái sinh lý và giai
đon phát trin ca ht phn cng nh hng đn hiu qu ca x lý. Tsay và c.s
(1988) thy rng kh nng hình thƠnh callus tng gp 2 ln khi x lý bao phn cha
bào t  giai đon gia và cui mt nhân trong 7-14 ngày, quá 14 ngày thì t l cây
xanh gim.
Nói chung đư có nhiu nghiên cu v nh hng ca nhit đ và thi gian x lý
đòng đn kt qu nuôi cy bao phn. Kt qu ca các tác gi cho thy rng x lỦ đòng
 nhit đ khác nhau s cho kt qu nuôi cy khác nhau.
1.4. Các giai đon chính trong nuôi cy bao phn
1.4.1. Khái nim nuôi cy bao phn
Nuôi cy bao phn cha các bào t hoc ht phn cha chín trong môi trng
nhân to nhm to cơy đn bi vƠ đc s dng rng rãi trong ci tin ging cây trng.
Thông qua phng pháp nƠy rút ngn thi gian chn to, tng tính bin d cho chn lc
và gii quyt vn đ lai xa. T đó to dòng thn t nuôi cy bao phn F1 hoc F2 trong

Yêu cu ca giai đon này là phi hn ch ti đa t l nhim nm và khun
trong phòng nuôi cy.
1.4.2.3. Ảiai đon 3: Tái sinh chi
Khi mu cy trong ng nghim đư to đc nhiu mô so thì tin hành cy tái
sinh. Yêu cu ca giai đon này là tái sinh mt cách đnh hng s phát trin ca mô
nuôi cy.
16

Quá trình đc điu khin ch yu da vào t l ca các hp cht
auxin/xytokinin đa vƠo môi trng nuôi cy.  tái sinh mu nuôi cy trong ng
nghim thng s dng chi đnh, chi nách, mô so…
1.4.2.4. Ảiai đon 4: Nhân nhanh chi
 to h s nhân chi cao nht, tin hành cy chuyn các chi đc tái sinh 
mu tái sinh sang môi trng dinh dng mi.
Ngi ta thng đa vƠo môi trng dinh dng nhân to các cht điu hòa
sinh trng: auxin, xytokinin…các cht b sung khác nh: nc da, dch chit nm
men…đng thi điu khin nhit đ ánh sáng thích hp…to điu kin tt nht cho
chi sinh trng tt, tng h s nhân chi tái sinh.
Tùy thuc vƠo đi tng nuôi cy ngi ta có th nhân nhanh bng kích thích s
hình thành cm chi hoc kích thích s phát trin chi nách.
1.4.2.5. Ảiai đon 5: Cy to r
Khi chi đt đc kích thc nht đnh ta cy chuyn các chi đó sang môi
trng ra r. Thng sau 2-3 tun t nhng chi riêng l này s xut hin r và phát
trin thành cây hoàn chnh.  giai đon nƠy ngi ta thng b sung vƠo môi trng
nuôi cy các auxin có chc nng to r ph t chi.
Thông thng, các nhóm cht IAA, NAA, 2,4D đc s dng nhiu trong quá
trình nghiên cu và sn xut, tác dng xúc tin hình thành r t chi tái sinh. Mi mt
loài cây, loi mô s yêu cu mt nng đ hoá cht khác nhau đ to r tt nht.
1.4.2.6. Ảiai đon 6: a cây tái sinh tr v điu kin sng t nhiên
ơy lƠ công đon cui cùng ca quá trình nuôi cy in vitro. Cơy đư tái sinh hoƠn

18

1.5.2. K thut đn bi trong công tác chn to ging cây trng
1.5.2.1. To cây t ht phn ca các dòng lai F1
Giá tr ca cơy đn bi trong công tác chn to ging đư đc phát hin t lâu.
Tuy nhiên, các cơy đn bi xut hin ngu nhiên vi tn s rt thp không th đáp ng
nhu cu ca nghiên cu và chn to ging ( Nng Vnh, 2005)
Nm 1964, ln đu tiên trên Th gii, 2 nhà khoa hc n  Guha và
Maheshwari thành công trong vic to cơy đn bi t nuôi cy bao phn in vitro cây cà
Datura innoxia. Ngay sau đó, cơy đn bi đư đc to ra bng nuôi cy bao phn 
hàng lot cây trng khác nhau. Ngoài nuôi cy bao phn các nhà khoa hc còn thành
công rt ln trong nuôi cy noưn cha th tinh, nuôi cy ht phn tách ri. K thut
này to ra nhanh chóng hàng lot cơy đn bi, phc v đc lc cho công tác chn to
ging cây trng.
Hai phng pháp nghiên cu cơy đn bi hin nay là :
-Nuôi cy bao phn hay tiu bào t tách ri, còn gi lƠ phng pháp trinh sinh
đc trong ng nghim.
-Nuôi cy t bào trng cha th tinh, còn gi lƠ phng pháp trinh sinh cái trong
ng nghim.
Ti Trung Quc, công ngh đn bi đư đc trin khai trên quy mô rng ln và
có đnh hng chin lc rõ ràng trong to ging mi. Hn mt nghìn c s nuôi cy
bao phn đư hot đng trên toàn quc t nhng nm 1970. Kt qu đư to đc trên
100 ging lúa mi trong mt thi gian ngn.
Ti Triu Tiên, k thut nuôi cy bao phn đư to ra 42 ging lúa mi (Sasson,
1993; Jain, 1997).
u th ca các phng pháp nƠy lƠ tt c các cây to thƠnh đu có ngun gc t
tiu bào t hoc đi bào t, vì vy con nhơn đc s lƠ cơy đn bi hoc nh bi đng
hp t tuyt đi vi các cp nhim sc th hoàn toàn ging nhau (tr trng hp đt
bin) ( Nng Vnh, 2005)