Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ – TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TĂNG SINH KHỐI
CỦA NẤM MEN RHODOTORULA Spp
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH
GVHD : TÔ MINH CHÂU
KHÓA HỌC: 2006 – 2010
Thành phố Hồ Chí Minh tháng 12 năm 2010
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh
Học trường Đại học Mở-TP.HCM đã truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức quý
báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Đặc biệt là với lòng biết ơn sâu sắc
đến cô Tô Minh Châu và thầy Ngyễn Văn Hanh đã tận tình hướng dẫn , góp ý cũng
như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp
này với tất cả tinh thần trách nhiệm và lòng nhiệt tình của Cô và Thầy.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ sinh học là ngành khoa học còn trẻ so với các ngành khoa học
khác.Trong những năm gần đây công nghệ sinh học là một trong những ngành
khoa học có bước đột phá khá lớn, nó đã và đang phát triển rất mạnh mẽ và là
một trong những ngành mũi nhọn hiện nay. Các thành tựu của công nghệ sinh

súc. Như việc bổ sung sinh khối nấm men Rhodotorula glutilis vào khẩu phần
thức ăn cho tôm sẽ vừa cung cấp khoáng , lipid vừa cung cấp carotenoid.
Cùng với sự phát triển của nền công nghiệp hiện đại, công nghệ sinh học
hiện đang là mối quan tâm hàng đầu của tất cả các nước đã và đang phát triển
trên Thế Giới hiện nay. Họ đã tập trung nghiên cứu để tìm và khai thác được
tối đa nguồn lợi từ vi sinh vật. Sử dụng vi sinh vật để sản xuất ra chế phẩm
sinh học, phân vi sinh, chất phụ gia, chiết suất protein, caroten, để thay thế
cho những nguồn trước đây và cũng chính điều này đã khơi dậy những ý tưởng
mới mẻ về những công trình nghiên cứu của rất nhiều người. Và để tìm hiểu
rõ hơn đồng thời bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu em đã tiến hành
làm đề tài “Khảo sát điều kiện tăng sinh khối của nấm men Rhodotorula spp”
với mục đích tìm ra được môi trường tối ưu nhất để vừa có thể thu được một
lượng lớn sinh khối vừa ít tốn kém về mặt tài chính cũng như thời gian nhất.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 4
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
PHẦN II: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT.
1. Sơ lược đặc điểm của nấm men nói chung[2,4,6,9]
1.1. Hình thái kích thước của nấm men.
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào và thường sinh
sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không chứa diệp lục tố và phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Nhiều loài trong nhóm này có khả năng lên men rượu
được áp dụng trong sản xuất rượu, bia, làm bánh mì Tế bào nấm men giàu
protein, vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B và tiền vitamin D
2
-bổ sung dinh
dưỡng vào thức ăn gia súc và có thể dùng chế tạo một số thực phẩm cho
người Tuy nhiên cũng có một số nấm men gây bệnh cho người và gia súc như
Candida albican, Cryptoccous và gây hư hỏng thực phẩm như Mycoderma.
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, tế bào nấm men

Trong màng nguyên sinh chất có các cơ quan như sau:
a. Ti thể
Là những hình cầu, hình que, hình sợi, kích thước khỏang từ 0,2-0,5×0,4-1
µm. Ti thể gồm 2 lớp màng: màng trong và màng ngòai. Màng trong có hình
sóng hay hình răng lược để tăng diện tích tiếp xúc, giữa 2 màng có các hạt gọi
là hạt cơ bản, bên trong ti thể là chất dòch hữu cơ.
Chức năng của ti thể là trạm năng lượng của nấm men:
+ Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra
khỏi cơ chất, làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP.
+ Giải phóng năng lượng khỏi ATP và chuyển dạng năng lượng đó thành
dạng năng lượng có ích cho họat động sống của tế bào.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
+ Tham gia vào việc tổng hợp nên một số hợp chất protein, lipit,
hydratcacbon, những hợp chất này tham gia vào cấu tạo màng tế bào.
+ Ngòai ra ti thể còn chứa nhiều lọai men khác nhau như: oxidaza,
xitocromxidaza, peoxidaza, photphataza
b. Riboxom
Số lượng riboxom thay đổi thụ thuộc vào từng loài, từng giai đọan phát triển
và từng điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại riboxom: lọai riboxom 70S và lọai 80S.
c. Các vật thể ẩn nhập khác
Không bào chứa các enzyme thủy phân, polyphotphat, lipit, ion kim lọai,
các sản phẩm trao đổi chất và điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển
của tế bào nấm men.
Ngòai ra còn chứa một số hạt dự trữ khác nhau, hạt lipit dưới dạng các hạt
nhỏ, các hạt glucogen, một ít hạt tinh bột.
1.2.3. Nhân
Nhân tế bào nấm men là nhân thật, nhân có sự phân hóa, có kết cấu hoàn
chỉnh và ổn đònh, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân

Nang bào tử được hình thành do hai tế bào nấm men tiếp hợp với nhau.
 Tiếp hợp đẳng giao: Do 2 tế bào nấm men giống nhau tiếp hợp
với nhau mà tạo thành.
 Tiếp hợp dò giao: Do 2 tế bào nấm men có hình thái kích
thước không giống nhau tiếp hợp với nhau mà tạo thành.
Sự tạo bào tử bắn
Ngoài các hình thức sinh sản trên, nấm men còn có khả năng tạo thành bào
tử bắn. Loại bào tử này sau khi tạo thành sẽ bắn ra đối diện.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
1.4. Phân lọai nấm men[2,4]
Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân lọai nấm men của nhiều tác giả
khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân lọai nấm men đầu tiên. Đến
năm 1952, J.Lodder đã cùng với Kreger Van Rij tổng kết lại một cách khá
hoàn thiện vấn đề phân lọai nấm men. Về khóa phân loại đến loài có khóa
phân lọai của Lodder là khóa phân lọai thông dụng nhất trên Thế Giới hiện
nay. Theo khóa phân lọai của Lodder (1971) nấm men được chia làm 39
giống. Nấm men không phải là các nấm thuộc một nhóm phân lọai thống nhất.
Chúng thuộc ngành thực vật bật thấp Eumycophyta nằm trong 2 lớp
Ascomycetes và Fungi Imperfecty.
1.5. Ứng dụng các loài nấm men trong cuộc sống.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, trong nước, trong
không khí, và nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp như trong
lương thực, thực phẩm, hoa quả, rau dưa, rỉ đường, trong đất ruộng mía, đất
vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ.
Sinh khối nấm men được ứng dụng trong nhiều lónh vực như trong nuôi
trồng thủy hải sản, chăn nuôi thú y, trong dược phẩm
Nhiều lọai nấm men được ứng dụng rộng rãi để nấu rượu, nấu bia, sản xuất
cồn, glixerin và điều chế một số hóa chất khác.

KOH. Nguyên sinh chất đặc, trong đó có chứa nhân tế bào có vỏ đặc thù và
những lỗ xốp lưới nội mô, không bào và chất béo ở dạng sệt và được bao
quanh bởi một màng sẫm.
2.2.3. Hình dạng và kích thước.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 10
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Tế bào nấm men Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài và
điều kiện nuôi cấy. Dạng thường gặp là trứng, elip, hình dài hoặc hình gậy.
Khuẩn lạc Rhodotorula có màu hồng cam khi phát triển trên môi trường
thạch Sabouraund, Malt, thạch khoai tây. Nấm men Rhodotorula không có giai
đọan sinh sản hữu tính và không có khả năng gây bệnh. Khuẩn lạc nấm men
Rhodotorula phát triển nhanh , trơn nhẵn, lấp lánh hoặc mờ đôi khi sần sùi,
nhầy.
Kích thước tế bào Rhodotorula dao động trong khoảng 2-5 µm chiều rộng và
khoảng 5-10 µm chiều dài. Kích thước này cũng thay đổi tùy theo loài khác
nhau, ở thời gian và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
2.2.4. Sinh sản và sinh trưởng.
Rhodotorula sinh sản bằng lối nảy chồi, một số sinh sản bằng cách phân
đôi. Tốc độ sinh sản của Rhodotorula khá nhanh, thời gian để số tế bào tăng
gấp đôi là 4-6 giờ. Qúa trình sinh sản của Rhodotorula cũng giống các loài
nấm men khác gồm 4 giai đọan: giai đọan thích nghi, giai đọan phát triển, giai
đọan ổn đònh, giai đọan diệt vong. Qúa trình sinh trưởng và phát triển của nấm
men Rhodotorula chòu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH, lượng
giống ban đầu.
2.2.5. Đặc điểm sinh hóa[10]
Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hóa sau:
- Không lên men yếm khí
- Không lên men carbolhydrates và sản xuất enzyme urease.
- Không đồng hóa inositol.

, K
+
Vi sinh vật lấy
khoáng từ môi trường dinh dưỡng. Có trường hợp phải bổ sung vào môi trường
một số dạng muối hoặc có khi chúng có sẵn trong các nguyên liệu pha môi
trường(đường, bột, cao ngô, rỉ đường ) và trong nước khoáng.
d) Vitamin: Vitamin là các chất sinh trưởng chính, đóng vai trò quan trọng
trong thức ăn bổ sung cho vi sinh vật. Một số vi sinh vật cần vitamin trong môi
trường dinh dưỡng, một số khác thì có thể tựï tổng hợp. Những vitamin có ảnh
hưởng đến vi sinh vật là vitamin PP (axit nicotinic), vitamin B1, vitamin B2,
biotin, axit pantotenic…Ngoài ra vitamin còn cung cấp Co-enzyme cho các
phản ứng sinh hóa trong tế bào, thường vitamin được đưa vào môi trường nuôi
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 12
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
cấy trong thành phần của chất chiết nấm men thì không cần bổ sung vitamin.
Nếu tạo nguồn Nitơ khác nhau thì phải thêm lượng nhỏ chất chiết nấm men để
bổ sung vitamin cho môi trường.
*Ảnh hưởng của yếu tố hóa học: Trong các yếu tố hóa học có ảnh hưởng
đến hoạt động sống của vi sinh vật ngoài yếu tố thức ăn còn các yếu tố khác
như pH môi trường, các hợp chất diệt khuẩn
pH môi trường có ảnh hûng rất lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật. Do
nó làm ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, pH thay đổi làm
điện tích màng tế bào chất thay đổi, dẫn đến làm thay đổi tính thẩm thấu của
màng. Cho nên sự hấp thụ các loại thức ăn cũng thay đổi, thêm vào đó pH làm
thay đổi hẳn chiều hướng của các phản ứng. Mỗi loài vi sinh vật có pH tối
thích và pH cực tiểu, cực đại riêng.
Ta không nên hạ thấp pH môi trường xuống vì làm như vậy nấm men sẽ
khó phát triển. Nếu pH cao quá vừa ức chế nấm men phát triển vừa tạo điều
kiện cho vi khuẩn nhiễm vào môi trường nuôi và phát triển, cạnh tranh chất

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Gía trò dinh dưỡng một số nấm men trong giống Rhodotorula [1]
Nấm men Hiệu suất
sinh khối/l
(gam/chất
khô)
%đạm/chất
khô
Lượng protein
(theo Nitơ)
gam/100g chất
khô
Tổng số
carotenoid mg
% chất khô
Rh.glutilis Mn 9,2 3,4 21,3 8,31
Rh.glutilisK-1 7,6 2,7 16,85 4,23
Rh.glutilis 320 10,8 4,04 25,12 5,82
Rh.glutilis 322 5,0 3,46 21,6 1,19
Rh.mucilonosa 323 6,6 3,0 18,7 1
Rh.rubra 329 11,0 4,0 25 1,84
Rh.rubra M
o
7,8 3,4 21,25 2,07
Rhdotorula chưa
đònh loại
11 2,28 14,25 2,01
Sinh khối nấm men Rhodotorula thu được chúng ta sẽ có được một sản phẩm
giàu protein, enzyme, vitamin, các chất khoáng cộng thêm có cả các

nhiều lọai thực phẩm, như chất tạo màu các lọai thực phẩm và thức uống.
Đồng thời các carotenoid cũng làm chất phụ gia, tạo lòng đỏ trứng gia cầm,tạo
màu cho thòt cá, tôm cua. Các carotenoid còn có họat tính chóng oxy hóa,
phòng ngừa ung thư.
Hiện nay các sản phẩm tổng hợp hóa học ít được chấp nhận trong việc làm
chất phụ gia cho thực phẩm và thức ăn vật nuôi do hậu quả không đảm bảo an
tòan cho sức khỏe. Do đó ứng dụng sinh khối nấm men Rhodotorula vào việc
thay thế các hóa chất trước đây là ứng dụng rất cần thiết và cấp bách. Sinh
khối này hiện nay đang được ứng dụng làm nguồn bổ sung vào thức ăn gia súc,
gia cầm và trong nuôi trồng thủy hải sản.
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 16
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
2.2.9. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận sinh khối[5]
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX.
Sau đó phương pháp nuôi cấy chìm đã được thay thế vào những năm 50 của
thế kỷ trước. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho
vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ không
phức tạp. Do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản
vừa không tốn kém.
Nguyên liệu thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám
mì, cám gạo, ngô mãnh, đậu nành và các lọai ngũ cốc khác. Trong các lọai
nguyên liệu trên cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều. Hai lọai cám
này có đầy đủ khoáng chất để vi sinh vật phát triển. Mặt khác khi tạo môi
trường chúng có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính,
vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều
trường hợp để tạo khả năng thoáng khí người ta cho thêm trấu vào. Thực chất

nhằm giảm được giá thành cho sản phẩm.
2. Vật liệu thí nghiệm.
2.1. Nguyên liệu làm môi trường và các hóa chất.
Nguyên liệu bao gồm: Nước gía đỗ, nước thơm, rỉ đường, (NH
4
)
2
SO
4
,
MgSO
4
.7H
2
O, gluccoza, chiết nấm men, peptone, KH
2
PO
4
, saccaroza.
2.2. Dụng cụ thí nghiệm.
Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: nồi hấp Autoclave, tủ ấm, tủ lạnh, kính hiển
vi, đóa petri, ống nghiệm, pipet, buồng đếm, thước đo
2.3. Đối tượng nghiên cứu:
Giống nấm men Rhodotorula spp
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Phương pháp thí nghiệm
3.1.1. Sơ đồ khối quá trình nghiên cứu
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 19
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu

Bảo quản ở nhiệt độ phòng
Kiểm tra số lượng tế bào sau thời gian bảo quản: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày.
Cụ thể các bước được tiến hành như sau:
3.1.2. Khảo sát độ thuần của giống.
a. Giống gốc: Giống được công ty Giấu Vàng cung cấp.
b. Môi trường cơ bản.
Môi trường cơ bản để giữ và nhân giống là môi trường Sabouraud.
Thành phần môi trường bao gồm:
Peptone: 20 g Thạch: 20 g
Gluccoza: 40 g Nước : 1000 ml
pH : 5,6-6
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 21
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Giống gốc từ công ty, đem cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng
Sabouraund. Sau 3-5 ngày nuôi cấy trên thạch nghiêng ta tiếp tục cấy lên môi
trường thạch đóa Sabouraund. Trước khi cấy lên môi trường thạch đóa ta phải
pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Sau 24 giờ quan sát bề
mặt thạch xem có khuẩn lạc lạ hay không, nếu có đem nhuộm Gram và quan
sát dưới kính hiển vi xem có phải vi sinh vật lạ hay không.
3.1.3. Khảo sát khả năng lên men, đồng hoá một số lọai đường.
Sau khi kiểm tra độ thuần của giống ta tiếp tục khảo sát khả năng lên men,
đồng hoá một số loại đường.Với mục đích kiểm tra lại một số đặc tính sinh
hoá của giống để khẳëng đònh lại độ thuần của giống.
Môi trường lên men đường có thành phần như sau:
Peptone: 10 g/l
Đường(lên men): 10 g/l
Phenol red, ống Durham
Nước cất: 1000 ml
pH = 5,5-6

(1g/l)
Môi trường 2: Nước giá đỗ(200g/l)+Gluccoza(20g/l)+Yeast extract(5g/l)
Môi trường 3: Nước giá đỗ(200g/l)+Gluccoza(20g/l)+peptone(5g/l)
Môi trường4: Nước thơm(200g/l)+Gluccoza(20g/l) +(NH
4
)
2
SO
4
(5g/l)
+MgSO
4
(1g/l) + KH
2
PO
4
l(1g/l)
Môi trường 5: Nước thơm(200g/l)+ Gluccoza(20g/l)+Yeast extract(5g/l)
Môi trường 6: Nước thơm(200g/l)+ Gluccoza(20g/l)+ peptone(5g/l)
Môi trường RĐ 4
0
Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH

0
Be
pH=5,6-6
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 23
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
Môi trường RĐ 8
0
Be:
(NH
4
)
2
SO
4
: 5 g/l
KH
2
PO
4
: 2 g/l
MgSO
4
: 1 g/l
Rỉ đường 8
0
Be
pH=5,6-6
Môi trường RĐ 10
0

4
(5g/l)
* Nhân giống nấm men trên môi trường dòch thể: Ống giống thuần được cấy
chuyền sang các môi trường nhân giống dòch thể.
Tiến hành nuôi cấy trên môi trường lỏng để nhân giống và thu sinh khối
nấm men. Những nghiên cứu ban đầu được tiến hành trên các môi trường
nhân giống đã nêu ở trên. Các môi trường được chuẩn bò sau đó được phân
phối vào các erlen hay chai nhỏ 100 ml chứa 50 ml môi trường. Đem hấp tiệt
trùng ở 121
0
C, 1amt trong 20 phút, để nguội. Ta cấy giống theo tỷ lệ 10%, cho
lần lượt 10ml nước muối sinh lý 9‰ vào trong các ống giống nấm men đã
được cấy chuyền nuôi cấy trước đó. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều tránh làm
bể thạch. Hòa đều rồi dùng pipet hút 5 ml cho vào các chai môi trường đã
chuẩn bò,mỗi ống giống cấy vào 2 chai môi trường. Tất cả thao tác phải được
thực hiện trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành nuôi ở chế độ tónh và lắc
SVTH: Nguyễn Thò Kim Loan Trang 24
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Tô Minh
Châu
ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành đếm số lượng tế bào sau 24 giờ, 48giờ , 72 giờ ,
96 giờ.ø Khảo sát xem môi trường nào sẽ cho lượng sinh khối cao nhất, ở thời
điểm nào thu nhận sinh khối là tốt nhất.
Trong 11 môi trường khảo sát ta chọn ra 3 môi trường tốt nhất trong 11 môi
trường. Lặp lại thí nghiệm với 3 môi trường này để tìm ra môi trường tối ưu
cũng như chọn thời gian và chế độ nuôi thích hợp nhất.
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng tăng sinh khối của nấm men
Rhodotorula spp
Ngoài môi trường nghiên cứu cần chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng như C,
N, các loại muối khoáng, vitamin để nấm men phát triển. Bên cạnh đó pH
cũng là một yếu tố đặc biệt quan trọng đối với quá trình sinh trưởng của nấm