BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA
ENDOGLUCANASE TỪ BACILLUS SUBTILIS S20

 
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN HÀ CÔNG THẮNG
TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG MSSV: 3092509
LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 12/2013
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
PHẦN KÝ DUYỆT

Trc tp và rèn luyn ti i hc C
nhc rt nhiu s ng viên c ng dn và ch dy
tn tình ca quý thy cô cùng vi s  nhit tình ca các bn. Vi vic hoàn
c lut nghic bày t lòng cc ca mình
n Th  ng
dn tình ch dy, truyt nhng kinh nghim quý báu trong vic thc hin thí
nghi và tu kin thun li nht cho tôi trong quá trình thc hi tài
này.
c gi li cn quý thy cô Vin Nghiên cu
và Phát trin Công ngh Sinh hn tình ging dy, giúp tôi có nhng kin thc
hu ích phc v cho vic thc hi tài.
Xin chân thành cm n sinh viên và các anh ch hc viên cao hc ca
phòng thí nghim Sinh hóa và phòng thí nghim Công ngh p th
lp Công ngh sinh hc tiên ti và chia s nhiu kinh
nghim quý báu trong sut thi gian tôi hc tp và thc hi tài này.
Cui cùng, tôi xin bày t lòng bi
ng viên, khích l và luôn ng h tôi v mt vt chn trong sut
thi gian tôi hc tp và thc hi tài nghiên cu này.
Kính chúc quý v nhiu sc khe, ht.
Xin trân trng c
C 
Hà Công Thng
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƢỢC
Đề tài “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ Bacillus
subtilis S20” được thực hiện nhằm mục tiêu thiết lập quy trình tinh sạch
endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 và xác định một số đặc điểm cơ bản của
endoglucanase tinh sạch. Dịch nuôi của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis S20, sau khi
được ủ kỵ khí trong 5 ngày ở 38

PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
t v 1
1.2. M tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tng quan v Bacillus subtilis 3
2.1.1. Lch s phát hin 3
2.1.2. Phân loi 3
m ca Bacillus subtilis 3
2.2. Tng quan v Endoglucanase 4
2.2.1. C hong ca endoglucanase 4
2.2.2. ng ca mt s yu t n hot tính ca endoglucanase 7
2.2.2.1. ng ca nhi 7
2.2.2.2. ng ca pH 7
c hiu t ca endoglucanase 7
2.2.2.4. ng ca mt s cht c ch và hot hóa 7
2.2.3. Mt s m khác ca endoglucanase 7
u 8
t ta protein 8
c ký 9
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
n di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate 
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) 11

4.6. Khc hit cch 30
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
5.1. Kt lun 31
5.2. Kin ngh 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Trang
 21
 24
 26
 tính 
29
 30
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Trang
 4
 5
 6
  6


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cellulose là ngung tái to dc xem là
vt cht hn ti vng ln nht và là thành phn chi
tuyi trong gii thc vt. Ngun nguyên liu sinh hc này có ti n
trong vic thay th nhiên liu hóa thn kit. K t 
công ty sn xuu tiên t c thành lp bi Ewan và các cng s,
  u nghiên c  c thc hi  tìm cách s dng hiu qu ngun
nguyên liu này.
Quá trình phân gii sinh hc c   c nghiên cu t nhi 
c bic nghiên
cu và khc phân loi vào nhóm enzyme glycosyl hydrolase, là
mu t xúc tác quá trình chuyn hóa cellulose thành glucose qua mt
chui các phn ng vi s tham gia ca các cu t bao gm endoglucanase,
- glucosidase. Mi cu t có m ng khác n phân
ct cu trúc polymer phc tp cc diu ct liên
kt -1,4-glycosidic trong phân t cellulose.
c ng d ci thin giá tr ng ca th

Cohn.
Bacillus subtilis c phát hin lu tiên trong phân nga bi T
chc y hc Nazi cc. Thm này, Bacillus subtilis c s d u tr
bnh kit l cho các binh c  chiu  Bc Phi.
Ngày nay, Bacillus subtilis c nghiên cu r khai thác các
ti  ng dng rng rãi trong nhi       , công
nghi
2.1.2. Phân loại
Theo phân loi ca Bergey, vi khun Bacillus subtilis thuc
Gii : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lp : Bacilli
B : Bacillales
H : Bacillaceae
Chi : Bacillus
2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuc nhóm vi khun hiu khí hoc k khí không bt buc, chúng
là loài vi khun ph bic tìm thc, không khí, và các loi
rác thi có ngun gc thc vt, tuy nhiên nhiu bng chng cho thy Bacillus subtilis
n ti trong rut ng vt (http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis
ngày 28/07/2013).
Bacillus subtilis thuc nhóm trc khuc khong 2,5-
ng nuôi cy (Sargent, 1975). Bacillus subtilis có kh 
bào t và tn tu kin khc nghit (Claus và Berkeley, 1986).
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
H enzyme ca Bacillus subtilis r     ng gm protease,
amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Bacillus subtilis 
c ng dng khá nhic bit là trong công nghip sn xu
amylase, cellul Bacillus subtilis ng lo

(*Nguồn http://discovery.kcpc.usyd.edu.au/9.2.2-short/9.2.2_CellulosetoEthene.html ngày
15/02/2013)
Phn ng thy phân liên k-1,4-glycosidic  acid/base
vi s tham gia ca các amino acid là aspartic acid và/hoc glutamic acid. S hình
thành ion oxic h tr và duy trì bn vng bi các amino acid cn k
trong tâm ho   aspartic acid, glutamic acid, tryptophan hay histidine
(Henrissat et al., 1989; Gilkes et al., 1991; Kawaminami et al., 1998; Gebler et al.,
1992). Tâm hong ca endoglucanase ca vi khung có trình t bo tn gm
8 amino acid, 2 tryptophan, lysine, serine, 2 tyrosine, glutamate và histidine (hình 3)
(Zvidzai và Johnson, 2012).
 lp th khác nhau trong s thy phân liên k -1,4-glycosidic:
thy phân o cu hình (inversion mechanism) và thy phân duy trì c   
(retetion mechanism) ca liên kt b phân ct (hình 4).
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 3. Giản đồ minh họa tâm hoạt động của endoglucanase
khi gắn với cellobiose
(*Nguồn: Davies et al., 1998)

Hình 4. Cơ chế lập thể của phản ứng thủy phân cellulose
(*Nguồn: Schülein, 2000)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CBD có vai trò gn kt vi enzyme vi s tham gia ca các amino acid
d1998). Domain này ci thin kh 
bám và h tr hot tính ct không nh
t hòa tan (Linder và Teeri, 1997).
2.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ

và -Mercaptoethanol. Trong khi Fe
3+,
Cd
2+,
Hg
2+
,
Sodium dodecyl sulfate hay Iodoacetic acid làm gim hot tính ca endoglucanase.
Các ion K
+
, Na
+
, Ca
2+
, NH
4
+
không n hot tính ca endoglucanase khi
c thêm vào phn ng (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000).
2.2.3. Một số đặc điểm khác của endoglucanase
Endoglucanase ca mi chng vi khun khng có trng phân
t ng, endoglucanase ca vi khung có M khong
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
23-146 kDa (Gilkes et al., 1991). Tuy nhiên, endoglucanase ca Bacilli ng trong
khong 35-82 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995; Kim et al., 1995; Mawadza et
al., 2000).
 n khác nhau tùy vào ngun trích ly.
ng, mt chng vi khung tng hp mt loi endoglucanase duy
nht. Tuy nhiên, có mt s chng có th tng hp nhiu loi endoglucanase khác nhau,

, MgSO
4
Tuy
n thy mui (NH
4
)
2
SO
4
là tt nht vì nó không nhng không phá
hy cu trúc mà còn làm nh hu ht các loi protein. Loi mui này li r tin và
ph bi hòa tan ca nó li rt ln (bão hòa 767g/l  25
o
C) 
2006).
N (NH
4
)
2
SO
4
cn thi kt ta các protein enzyme khác nhau thì khác
nhau nhiu.
2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký
c ký là mt trong nhc ng dng
rng rãi nht hin nay vì u qu nh tách các cht ra khi
mt hn hp ngay c vi nhng hn hp phúc tp. c
Nga .
Nguyên tn ca sc ký là da vào s khác bit v ái lc ca các cu t
trong hn hp cht cn phân tích vng có th là cht

 c ra gii ra bng dung dch mui hoa gii
là ra gii gradient liên tc (continuous gradient) và ra gii tc (stepwise).
Các protein s y ra khi ct da vào m n ca tng protein,
nói cách khác da vào lnh hay yu c
u s c li.

Hình 6. Minh họa sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn: Biochemistry, 7
th
edition)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.3. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate –
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)
  -PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
c gn di không liên tc và gây bin
tính mu c phát trin t n vc s dng ph bin  các phòng
thí nghic nghiên cu ci ting nhu cu ca thc tin
nghiên cuc x lý vi SDS là tác nhân làm bit tính và
âm tính hóa các phân t protein và -mercaptoethanol hoc dithiotheitol (DTT) là tác
nhân kh cu ni disulfite. Khi x lý protein vi 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol
thì các tác nhân này s ct các cu ni disulfite (SS) ca protein, vì vy protein t
cu trúc bc 2c bii thành chui polypeptide bc mt và nh s có mt
ca SDS tt c n âm. Nh ng cn
ng các phân t n âm s di chuyn v c và s di chuyn này ch
ph thuc, nhng phân t c ln s di chuyn ch
nhng phân t c nh t l c nhnh.
SDS-PAGE s dng h thng gel không liên tc gm hai lp: lp gel tp trung
hay gel gom (stacking gel) và lp gel phân tích (running gel hoc separating gel). Lp
gel t     to gi    ng có n  gel thp vào

 hp th ca dung dch  c sóng 595nm.
 nh protein trong mu tiên ta xây dng mng chun vi dung
dch protein chuc n. Dung dch protein chung là bovine
serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dch protein vào dung dch thuc nhum,
màu s xut hin sau 2 phút và bn ti 1 gi. Ti quang hn hp dung
dch bng máy quang ph k (Bài ging thc hành sinh hóa, 2009). Hình 8. Công thức cấu tạo của Coomassie Brilliant Blue G-250
(*Nguồn: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02051005 ngày 4/07/2013)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme
*  pháp nh tính bng  ng kính vòng halo
Mnh mu có ho tip tc thc hi
giá khác.
Nguyên tc: Congo red liên kt vi cu n -1-4-glycosidic nguyên vn trên
CMC t trên b mng và không b ra trôi bi dung dch NaCl. Khi
liên kt này b ct bi endoglucanase, congo red không còn tip tc bám và b ra trôi.
c tin hành bng cách nh git mu enzyme vào các gic
sng chc   nhi và thi gian
thích h enzyme phn ng. Sau n hành nhum trong 15 - 60 phút, ri ra li
bng dung dch  mu có hot tính thy
phân cu n-1-4-glycosidic s to vùng không bt màu vi congo red xung quanh

là 113, 5 ln và hiu sut 35,3 %,. Endoglucanase t hai chng vi khun này có
cùng trng phân t và pI là 40kDa và 5,4. C hai có pH tng 5-
6,5 và có nhi tn lt là 65
o
C và 70
o
i vi CH48 và HR68. Ion Co
2+
có
kh t hóa c enzyme ca c hai chng, trong khi, Mn
2+
và Hg
2+
c ch hot
tính ca hai enzyme này. Ion Ag
+
có kh   t enzyme ca chng HR68
i bt hot chng CH43. Hai enzyme này có hot tính cao nh-glucan
và k        t tính vi mt s   
hydroxyethylcellulose, avicel, giy l    t tính vi hemicellulose

      có báo cáo v kt qu tinh sch
Carboxymethyl Cellulase (Endoglucanase) t mt ch c phân lp t
rung lúa. Trong nghiên c dng pháp
ta bng ammonium sulphate (AS) và tin hành tinh sch lt bng si
ion trên gel diethylaminoethyl (DEAE) cellulose và sc ký lc gel vi gel Sephadex G-
75. Sn phm tinh sng k thut SDS-PAGE. Kt qu cho thy sau
quá trình tinh sch gc k  tinh sch là 14,5 ln và hiu sut 24% .
Carboxymethyl Cellulase tinh sch t chng vi khun này có trng phân t 58
kDa, có nhi và pH t

, b c ch bi SDS, DTT
hay Fe
2+
, Fe
3+
, Hg
+
, Cd
2+
.