TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN
===£0lGũlGa===
KHƯƠNG THỊ BÍCH
■
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG
LÚA ƯU TÚ (NSC46 - NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
SSR
KHÓA LUÂN TỐT NGHIÊP ĐAI HOC • • • •
Chuyên ngành: Dỉ truyền phân tử
Ngưòi hướng dẫn khoa học TS.
KHUẤT HỮU TRUNG
HÀ NỘI – 2015
■
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của
TS. Khuất Hữu Trung, viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. Nội dung nghiên cứu, các
trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực, không sao chép từ bất cứ tài liệu nào, toàn bộ đều là công trình nghiên cứu của
cá nhân tôi qua quá trình tìm tòi, học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chịu trách nhiệm
về đề tài nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên
Khương Thị Bích
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn, sự cảm kích sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung
đã dành nhiều thòi gian, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình
học tập nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thảnh tới đội ngũ cán bộ Bộ môn Kỹ thuật di truyền -
viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn kỹ thuật, cung cấp cho tôi
những thông tin và tài liệu bổ ích giúp tôi hoàn thành luận văn này.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tói quý thầy giáo, cô giáo khoa Sinh - KTNN Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giảng dạy, tâm huyết, truyền đạt kiến thức và kinh
nghiệm của mình cho tôi trong suốt 4 năm học qua.

hơn một nửa dân số thế giói. Lúa gạo được trồng ở nhiều nơi ừên thế giới, có diện
tích gieo trồng đứng thứ hai sau lúa mì. Tổng sản lượng lúa đứng thứ ba sau lúa
mì và ngô. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng của cả thế
thế giới phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Á (chiếm 13 nước trong tổng số 15
nước trồng lúa với diện tích hơn 1 triệu ha).
Ở Việt Nam, vói vị trí địa lí và điều kiện khí hậu thuận lọi nước ta là một
trong những nước có truyền thống về lúa nước cổ xưa nhất thế giới. Dân số nước
ta hiện có hơn 80 triệu người và 100% người Việt sử dụng lúa gạo làm lương thực
chính. Nông nghiệp trồng lúa nước vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa
là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Vì vậy, lúa có vai trò vô cùng quan trọng
trong nền kinh tế quốc dân.
Với lịch sử lâu đời về trồng lúa, nước ta có một nguồn gen lúa tự nhiên YÔ
cùng phong phú và đa dạng từ các loài lúa trồng và lúa hoang dại (Trần Thị Hòa,
Triest, 1999)[3]. Để có thể khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả nguồn gen
này, trong chọn giống càn phải có những hiểu biết cơ bản và thiết yếu về mức độ
đa dạng di truyền giữa các giống. Sự phát triển và những thành tựu đạt được trong
sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ thích họp cho nghiên cứu đa dạng di
truyền, cho phép ta xác định khoảng cách di truyền một cách nhanh chóng và
chính xác.
Trong số các chỉ thị thì chỉ thị SSR được đánh giá là có nhiều ưu điểm hơn
so với các chỉ thị khác, đơn giản ữong phân tích di truyền, có khả năng cho đa
hình cao, có bản chất đồng trội, có độ chính xác cao, di truyền theo quy luật
Menden.
5
Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa có ý nghĩa to lớn trong việc đánh giá,
phân loại và sử dụng nguồn gen trong chọn tạo giống lúa. Do vậy, xuất phát từ
những hiểu biết về đa dạng di truyền, để khai thác được nguồn gen quý phục vụ
cho chọn giống chúng tôi tiến hành thực nghiệm đề tài nghiên cứu: “Đánh giá đa
dạng dì truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 - NSC68) bằng chỉ thị phân tửSSR”.
2. Mục đích nghiền cứu

góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo
giống lúa có phẩm chất tốt, năng suất cao, phù hợp với điều
kiện khí hậu, môi trường sống và cơ cấu sản xuất lúa trong
các vùng ở Việt Nam.
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc cây lúa
Cây lúa là một trong những cây trồng có lịch sử lâu đời nhất thế giói, là
một trong năm loại cây lương thực chính của thế giói, cùng với ngô (Zea maysL.),
lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz) và khoai tây ị Solanum
tuberosum L.). Người ta cho rằng lúa là một cây trồng cổ, có vai trò quan trọng
trong đòi sống và lịch sử phát triển của hàng ngàn triệu người trên thế giới. Căn
cứ vào các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam cây lúa đã có mặt
từ 3.000-2.000 năm TCN. Ở Trung Quốc, vùng Triết Giang đã xuất hiện cây lúa
5.000 năm, ở hạ lưu sông Dương Tử 4.000 năm. Tuy nhiên trên thực tế vẫn còn
nhiều ý kiến cụ thể khác nhau về nguồn gốc xuất xứ của cây lúa, nhưng xét về
phương diện sinh thái, sinh học thì cây lúa và nghề trồng lúa đã có từ lâu đòi gắn
liền với lịch sử phát triển của loài người, nhất là ở Châu Á.
về nguồn gốc thực vật, trên thế giới có hai loài lúa trồng được xác định tò
thời cổ đại cho đến ngày nay. Thứ nhất là lúa trồng Châu Á (Oryza sativa), nguồn
7
gốc xuất phát ở nơi nào vẫn là đề tài tranh luận của các nhà khoa học trên thế giới
và ngày càng sáng tỏ với những khai quật khảo cổ học có tính đột phá và những
phương pháp phân tích hiện đại dựa trên cơ sở phân tích phóng xạ. Thứ hai là loài
lúa trồng Châu Phi(Oryza glaberrỉma), được xác định có nguồn gốc ở thung lũng
thượng nguồn sông Niger (nay thuộc Mali).
Trước đây có 4 giả thuyết về xuất xứ đàu tiên của giống cây trồng Châu Á,
đó là: nguồn gốc Trung Quốc, nguồn gốc Ấn Độ, nguồn gốc Đông Nam Á và giả
thuyết đa trung tâm phát sinh. Tuy nhiên, các giả thuyết phần lớn đều bị bác bỏ.
Chang (1985)[11], chuyên gia di truyền lúa của IRRI, xem xét lại tất cả tài liệu và

về phân loại thực vật,
Giới (kìngdom/regnum):
Ngành (phyla):
Lớp (class):
Bộ ịordo):
Họ (familia):
Chi (genus):
Loài (species):
Phân loài/thứ (subspecies):
cây lúa thuộc:
Thực vật
(Plantae)
Thực vật có
hoa
(Angiosperm
ae) Thực vật
một lá mầm
ịMonocots)
Hòa thảo
(Poales)
Hòa thảo
(Poaceae)
Lúa (Oryza)
Lúa Châu Á
(oryza sativa)
Lúa Châu Phi (oryza glaberima)
Lúa nhiệt đới: oryza sativa var ỉndỉca
Lúa ôn đới: oryza sativa var japonica
Lúa rẫy : oryza sativa var javanica
Đối với lúa trồng có nhiều cách phân loại khác

và lúa gạo nói riêng như:
chính sách đầu tư vật chất
kỹ thuật thích đáng về thuỷ
lợi, giống lúa, thâm canh,
quảng canh lúa qua từng
thời kỳ. Lúa gạo đã được
đưa vào 2 trong 3 chương
trình kinh tế lớn của quốc
gia (như văn kiện Đại hội
Đảng toàn quốc tháng
12/1986 đã nêu). Nhờ đó,
từ năm 1989 đến nay kim
ngạch xuất khẩu gạo đã
không ngừng tăng, mang lại
nguồn thu ngoại tệ lớn góp
phần không nhỏ cho công
cuộc đổi mới và xây dựng
đất nước. Cũng do thực
hiện thực hiện chương trình lương thực, Việt
Nam từ nước nhập lương thực hàng năm khoảng
1 triệu tấn thành nước xuất khẩu 3-4 triệu tấn
gạo hàng năm[20].
1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và
Việt Nam
1.3.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo Tổ chức Lương nông Quốc tế FAO,
năm 2012 sản lượng lúa thế giới đạt 721 triệu tấn
(tương đương 480 triệu tấn gạo) so với 700 triệu
tấn năm 2010, tăng 3%. Sản lượng tăng cao do
mở rộng diện tích canh tác lên đến 164 triệu ha,

một số nước gia tăng và số
lượng lúa gạo thặng dư tại
các nước xuất khẩu, sự trao
đổi lúa gạo thể giới đạt mức kỷ lục 40,2 triệu tấn
gạo hay 8% cao hơn
2013.
Tháng 2/2014, Chính phủ quân nhân Thái
Lan hủy bỏ chương trình trợ giá gạo lớn lao của
Chính phủ trước, thúc đẩy xuất khẩu gạo tồn
kho, hạ thấp giá để giúp nước này phục hồi
ngành xuất khẩu truyền thống và đã trở lại ngôi
vị xuất khẩu gạo hạng nhất trong 2014 (bảng
1.1).
Bảng 1.1: Sản lượng gạo xuất khẩu và dự trữ
gạo tại một số nước trên thế giói
Theo thống kê của FAO năm 2014, trong 2
năm 2013 và 2014 sản lượng gạo trên thế giới
Quốc gia
Sản lượng gạo
(triệu tấn)
Xuât khâu gạo (triệu
tấn)
Gạo tôn trữ
(triệu tấn)
Năm 2013 2014 2013 2014 2014
Thê giói 497,5 496,6 37,3 40,2 177,5
Trung Quôc 140,7 141,7 0,5 0,3 99,9
An Độ 106,5 103,5 10,5 9,5 23,5
Indonesia 44,9 44,0
- -

của thế giới không ngừng
tăng lên trong những năm
vừa qua nhưng năng suất và
chất lượng gạo còn thấp,
chưa đảm bảo được an ninh
lương thực toàn cầu. Ở Châu Phi, có rất nhiều
nước đang trong tình trạng thiếu lương thực
nghiêm trọng. Bên cạnh đó, diễn biến thời tiết
khí hậu có tính chất rất phức tạp như lũ lụt, hạn
hán làm ảnh hưởng đến nền sản xuất nông
nghiệp, nhất là ngành sản xuất lúa gạo. Vì vậy,
việc lựa chọn những giống lúa phù hợp với từng
vùng, từng địa phương là rất quan trọng.
1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Viêt Nam
Ở Việt Nam, sản xuất lúa gạo giữ vai trò
quan ữọng trong nền sản xuất nông nghiệp,
chiếm gần 50% GDP. Gần đây diện tích đất trồng
lúa có xu hướng giảm xuống nhưng sản lượng
lúa gạo không ngừng tăng lên, bởi hiện nay năng
suất lúa tăng cao. Năng suất lúa bình quân của
Việt Nam vào khoảng 48,9 tạ/ha xếp thứ hai sau
Indonesia. Diện tích trồng lúa Việt Nam là
7326,2 nghìn ha xếp thứ hai sau Trung Quốc.
Từ năm 1990 đến nay, sản lượng lúa gạo
Việt Nam liên tục tăng trưởng nhờ có các giống
lúa mới, ngắn ngày đáp ứng cho nhu càu mở
rộng diện tích canh tác hàng năm. Các biện pháp
kỹ thuật canh tác tốt được áp dụng trên phạm vi
rộng, sản lượng và năng suất/đơn vị diện tích
(ha) tăng đáng kể Tất cả những yếu tố trên đã

gạo trong
2014, Việt Nam có thể xuất khẩu 6,9 triệu
tấngạo trong 2015 do được mùa năm qua, mà
phần lớn đến các nước nhập khẩu chủ yếu:
Trung Quốc, Philippines và Đông Nam Á. Thái
Lan sẽ tiếp tục vai trò dẫn đầu xuất khẩu gạo thế
giới ở tầm mức cao hơn, khoảng 11 triệu tấn gạo,
do họ còn gạo tồn kho khá lớn.
1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua
chỉ thị phân tử SSR ( Simple Sequence
Repeats).
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những
đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và
chỉ gồm 1 - 6bp. Trong cấu trúc gen của sinh vật
nhân chuẩn, có những đoạn DNA gồm những
đoạn trình tự giống nhau và lặp lại.
Có các trình tự lặp lại:
Bảng 1.2: Diện tích trồng lúa và tổng sản lượng lúa từ 1990-2012
Năm 1990 1995 2000 2005 2010 2011 2012
Diện tích(triệu ha) 6,04 6,77 6,67 7,33 7,49 7,65 7,75
Sản lượng(triệu tân) 19,23 24,97 32,51 35,64 39,99 42,31 43,7
Năng suât(tạ/ha) 31,8 36,9 42,4 48,9 53,4 55,3 56,0
(Nguồn: Báo điện tử Đảng Cộng Sản Việt Nam tháng 4/2014)
- Lặp lại hoàn toàn: các đơn
vị lặp lại xếp nối tiếp nhau
[13],[14].
- Lặp lại không hoàn toàn:
xen kẽ vào các đơn vị lặp
lại là một hoặc một số
nucleotide khác.

đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của
cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính
trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây
lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số
lượng (DTL). ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR
Thuận lợi to lớn của việc phân tích chỉ thị
SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn
sự đa hình.
SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử
có thể dễ dàng được xác định trong quá trình
thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng
sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính
toán di truyền quàn thể dựa trên những marker
này so vói những marker khác như AFLP và
RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế
hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai
giống, dòng chảy gen ữở nên dễ dàng hơn
(Schlotterer et al., 1994). SSR là công cụ hữu
hiệu để chọn lọc giống, đa
dạng hóa về các vật liệu di
truyền và dùng ữong thiết
lập bản đồ di truyền.
Hạn chế của chỉ thị
này là cần nhiều bước tiến
hành, cần thiết kế các cặp
mồi chính xác và tương ứng
với hai đầu của đoạn DNA
chứa trình tự lặp lại. Bên
cạnh đó, quá trình thiết kế
primer quá đắt, mỗi loại

cao hơn chỉ thị AFLP. Các tác giả cũng chỉ ra
rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có
thể nghiên cứu các alen dị hợp tử ở lúa[15].
Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của
38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng chỉ thị
SSR của tác giả Raj (Raj et ah, 2006). Tác giả đã
sử dụng 32 cặp mồi, kết quả nghiên cứu cho
thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC
dao động từ 0,00 (RM259 và RM230) đến 0,83
(RM420)[16].
Năm 2009, Kibria K và cộng sự đã đánh
giá đa dạng di truyền các giống lúa thơm bằng
cách sử dụng các marker SSR và RAPD. Ba mồi
SSR là RM223, RM342A và RM515 đã thu được
46 băng, trong đó số alen
trung bình dao động từ 1,78
đến 2,49. Mồi RM223 cho
thấy mức độ đa hình cao
nhất là 66,67%.
Ngoài ra tác giả còn sử
dụng 15 mồi RAPD, ừong
đó có 3 mồi OPA-O2, OPA-
10 và 67AB10G7 tạo ra 32
băng đa hình và 2 băng đơn
hình, riêng mồi OPA-02 và
67AB10G7 thu được tất cả
các băng đa hình. Kết quả
phân tích SSR cho thấy
khoảng cách di truyền cao
nhất giữa các giống lúa

Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định
giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker
SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn
các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả
người nông dân và người tiêu dùng. Theo
SinghBalwant (2011), nghiên cứu đa dạng di
truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR,
hình thái, đánh dấu hóa lý. Kết quả SSR marker
phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các
giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao
động từ 0,139-0,99 với
trung bình 0,589 cho mỗi
mồi[19].
Theo Shahid Masood
Shah (2013), Sử dụng
marker phân tử đánh giá đa
dạng di truyền của 40 giống
lúa thơm và không thơm
bằng chỉ thị SSR, 40 giống
lúa này được đánh giá bởi
24 mồi. Kết quả cho thấy
có tổng cộng 66 alen và hệ
số alen dao động từ 2-4,
trung bình là 2,75
alen/marker, hệ số PIC dao
động từ
1, 4250 (RM252) đến
0,9750 (RM315). Hệ số PIC
trung bình của 24 cặp mồi
nghiên cứu trên 40 giống

Nam gắn với nền văn minh lúa nước nên được
coi là trung tâm khởi nguyên của cây lúa. Tài
nguyên di truyền lúa nước Việt Nam được đánh
giá là phong phú cả về số lượng và chất lượng.
Những công trình nghiên cứu về đa dạng di
truyền và phân loại một cách có hệ thống lúa
trồng ở Việt Nam còn hạn
chế. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây các nhà khoa
học đã tập trung nghiên cứu
quan tâm nhiều hơn đến vấn
đề đánh giá đa dạng tài
nguyên lúa để phục vụ cho
việc chọn lai tạo ra các
giống mới có năng suất chất
lượng cao và khả năng
chống chịu tốt.
Kết quả nghiên cứu đa dạng
di truyền của 101 giống lúa
địa phương bằng 9 locus
thuộc 5 enzim. Kết quả cho
thấy, trong số các giống thu
từ huyện Nho Quan - Ninh
Bình và huyện Đà Bắc -
Hòa Bình thì có 44 giống
(chiếm 43,6%) thuộc lúa
Indỉca và 57 giống (56,4%)
thuộc lúa Japonica (Trần
Danh Sửu và cộng sự,
2004) [5].

dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27). Các
giống lúa Tám nghiên cứu có độ thuần di truyền
khá cao, tỉ lệ dị hợp tử trung
bình của cả tập đoàn là 0,86.
Hệ số tương đồng di truyền
của các giống trong tập
đoàn nghiên cứu dao động
trong khoảng 0,14-1,00. Ở
mức tương đồng di truyền
40%, tập đoàn 26 giống lúa
Tám thơm được chia thành
3 nhóm lớn. Trong đó, hai
giống Tám Nghĩa Hồng và
Tám con có kiểu gen giống
nhau ở cả 36 locus nghiên
cứu. Kết quả nghiên cứu rất
có ý nghĩa phục vụ công tác
nghiên cứu lai, chọn tạo
giống lúa chất lượng (Khuất
Hữu Trung và Nguyễn Thị
Phương Đoài, 2010).
Tiếp đó, Khuất Hữu
Trung và cộng sự cũng đã
sử dụng 29 cặp mồi SSR để
nghiên cứu đa dạng di
truyền tập đoàn 27 nguồn
gen lúa nếp, lúa nương bản
địa ở Việt Nam. Kết quả thu
được 96 loại alen, hệ số PIC
dao động từ 0 đến

phụ Japonỉca và 2 giống
(Nếp nõn tre và Nếp hạt
chanh) thuộc loài phụ
Indica dựa trên DNA lục
lạp[6].
Năm 2012, Vũ Thị
Thu Hiền và Phạm Văn
Cường đã phân tích đa dạng
di truyền của 64 dòng/giống
lúa đang canh tác trong điều
kiện nhờ nước trời thông
qua sự có mặt và mức độ đa
hình của các chỉ thị phân tử
SSR. Bằng việc sử dụng 34
chỉ thị phân tử SSR, có 8
chỉ thị không cho xuất hiện
vạch ở tất cả các
dòng/giống; 2 chỉ thị xuất
hiện yạch đơn hình; 24 chỉ
thị còn lại xuất hiện đa hình
với tổng số 90 alen chiếm tỷ
lệ trung bình 3,75 alen trên
một locus. Kết quả phân
tích đa dạng di truyền với
hệ số tương đồng là 0,65 đã
phân chia nguồn vật liệu
thành 7 nhóm chính, số lượng lớn các
dòng/giống thuộc hai nhóm có hai giống đối
chứng chịu hạn là CH5 và LC93-l.Kết quả này
bước đàu cho thấy các dòng/giống có khả năng

tú được chọn tạo và nhập nội do Công ty Giống
cây trồng Trung Ương cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Danh sách 23 mẫu giống lúa ưu tú
nghiên cứu
STT Tên
mẫu
Kí hiệu
mẫu
STT Tên
mẫu
Kí hiệu
mẫu
1 NSC46 S46 13 NSC58 S58
2 NSC47 S47 14 NSC59 S59
3 NSC48 S48 15 NSC60 S60
4 NSC49 S49 16 NSC61 S61
5 NSC50 S50 17 NSC62 S62
6 NSC51 S51 18 NSC63 S63
7 NSC52 S52 19 NSC64 S64
8 NSC53 S53 20 NSC65 S65
9 NSC54 S54 21 NSC66 S66
10 NSC55 S55 22 NSC67 S67
11 NSC56 S56 23 NSC68 S68
12 NSC57 S57
TT Tên
mồi
Trình tự mồi NST
Kích
thước
(bp)

8 RM224 F:ATCGATCGATCTTCACGAGG
R:TGCTATAAAAGGCATTCGGG
11 120-152
9 RM585
F:
CAGTCTTGCTCCGTTTGTTG
R:
6 171-233
10 RM372
6
F: CAC AC AC ATCGCTCGGTC
R: GATGTGGAGGTCGATGGC
12 193
11 RM630
8
F:
TCGACCTGGCTCTCCTCTAG
3 104
12 RM699
7
F: CA ACGCGGCAGTA
AATTTGC R:
4 154
13 RM821
3
F:AGCCCAGTGATACAAAGATG
R:
4 177
14 RM313
4

F: GGCTCGATCTAGA
AAATCCG
R:TTGCACAGGTTGCGATAGA
6 215-221
21 RM1233
F: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG
R:ATTGGCTCCTGAAGAAGG
11 175
22 RM7102 F:TTGAGAGCGTTTTTAGGATG
R:TCGGTTTACTTGGTTACTCG
12 168
23 RM261
F:
CTACTTCTCCCCTTGTGTCG
10 125
24 PTA248 F:AGACGCGGAAGGGTGGTTC
CCGGA
R:AGACGCGGTAATCGAAAGA
11 500-1000
25 RM6320
F: GAGCTGGACCTCCTCGAC
AC R:
5 164
26 MP1-
MP2
F:ATCGATCGATCTTCACGAGG
R:TCGTATAAAAGGCATTCGGG
8 150
Mẩu lá của từng
dòng được thu riêng rẽ và

IS0A (24:1). Thu được dịch chiết chứa DNA.
6. Tủa DNA bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở
-20°c trong 1 giờ.
7. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút
ở 4°c.
8. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm
khô và hoà tan trong đệm TE.
9. Độ tính sạch và nồng độ DNA tổng số được
kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose
1%.
2.2.2. Phản ứng PCR đánh giá đa dạng dì
truyền bằng chỉ thị SSR
Tổng thể tích của phản ứng PCR là 15|xl bao
gồm: 1,5)0.1 đệm PCR10X;
l,2fxl MgCl
2
25mM; 0,3ỊXỈ dNTPs lOmM; 0,2|
il Taq DNA polymerase 5U/|il;
lịil mồi xuôi 10|iM; lịil mồi ngược 10|iM; lp.1
DNA (30ngẠil); 3,8|il nước cất 2
lần khử ion.
2.2.3. Chu ừình PCR
Bảng 2.3: Chu kỳ nhiệt
cho phản ứng PCR sử
dụng mồi SSR
2.2.4. Điện di kiểm tra sản
phẩm PCR
Sản phẩm PCR được
điện di trên gel
polyacrulamide 6,0% và

Dung dịch acrylamide 40% 10,5ml
Dung dịch APS 10% 700|il
Dung dịch TEMED 58,4|il
Tông thê tích gel 70ml
trình Exel version 5.0 và
phần mềm NTSYSpc 2.1
(Rohlf FJ, 2000).
Hệ số PIC
(Polymorphic Information
Content) được tính theo
công thức
sau:
PIC =1 - ZPj
2
(trong đó Pi là
tần số xuất hiện của alen
thứ i).
Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi
mẫu được tính theo công
thức:
H % =
———
Trong đó: X: là
Trong đó: z là tổng
số mồi không xuất hiện
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ
NGHIÊN cứu
3.1. Kết quả tách chiết DNA
Tách chiết DNA là công việc đầu tiên
đóng vai trò quan ừọng trong công nghệ DNA.