Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây
dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm
(Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch Nguyễn Thị Thanh Nga Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: PGS.TS. Đinh Đoàn Long
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tìm hiểu chi codonopsis; tổng quan về mã vạch AND (DNA barcode);
một mã vạch AND được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu; ứng dụng mã
vạch AND trên thực vật. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND
tổng số; kiểm tra sản phẩm AND sau tách chiết; phương pháp nhân bản gen đích
bằng kỹ thuật PCR; tinh sạch sảm phẩm PCR và giải trình tự; phương pháp phân tích
số liệu. Kết quả nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; khuyếch đại vùng gen nghiên
cứu bằng kỹ thuật PCR.

Keywords. Sinh học; Di truyền học; Đa dạng di truyền; Cây dược liệu; Kỹ thuật
AND mã vạch Content
MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế),
tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài

barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng
chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc
bảo quản lâu dài.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài
Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch
có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp
phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã
vạch như ITS, matK, trnK. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chi Codonopsis
1.1.1. Phân loại học
Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:
 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)
 Giới: Plantae (Thực vật)
 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)
 Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)
 Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)
 Phân lớp: Asteriades
 Bộ: Asterales (Bộ Cúc)
 Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)
 Phân họ: Campanuloideae
 Chi: Codonopsis
1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố
Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ
hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo
lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu
trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn.

Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong có nếp
nhăn ngắn. Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc.
- Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân lá đều có lông dài, lá
hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa. Cánh hoa sâu, dài bằng nửa ống hoa, tràng
hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc.
- Xuyên đảng sâm (Codonopsis tangshen
Oliv); hình thái cơ bản giống loài C. pilosula
(Franch) Nannf nhưng lá hình trứng hay hình
trứng đuôi nhọn, mặt lá không có lông, chỉ rìa
lá có lông nhung. Sau khi ra hoa (Hnh 3) thì
có quả đuôi màu trắng tím, trong hoa có sọc
nhỏ màu tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại
trên, ở chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả
chín không nứt.

Hnh 3. Hoa Codonopsis tangsheng
- Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf) lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép
nguyên, hai mặt đều có lông. Hoa (Hnh 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm, màu lam
nhạt, trong có thới màu tím đậm.
Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hnh 4b) có rễ hình
chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hnh 4c) có rễ hình củ tròn, thường được trộn
lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện
Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc;
còn ở phía Nam, chỉ có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai
châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà
Nẵng và Lâm Đồng.

Hnh 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis lanceolata, và (c)
C. ussuriensis.
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ

gen.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề
xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài. Mã vạch được sử
dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy
quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc
chưng của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống
nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân
biệt được. Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :
(i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;
(ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;
(iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài.
1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tnh hnh nghiên cứu
1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật
Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do có các tiêu
chí: đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ, gen này cho mức độ phân biệt cao. Đó là
một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào. Ở động vật, nó
có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn
nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen
CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất
sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài. Nhiều nghiên cứu cho thấy
CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác định hẹp
đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa
mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb
(cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng
ở động vật .
1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật
Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật và một số
loài tảo, thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ
cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch. Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen
lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen

rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo
phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp
nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một
phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính
xác và phổ biến hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã
vạch ADN có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo,
đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng. Dưới đây trình bày một số
mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong các cây dược liệu.
Vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng xử lý tốt
nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã được sử dụng thành công để phân
biệt 14 lòai Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u
“Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H.
corymbosa (L.) Lam.
Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược
"Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex
Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi
nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định
các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau.
trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và tỷ lệ sai khác là
83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL và matK. Vì vậy, trnH - psbA
được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó được
dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl. ex. Hook.f.
(Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ
2% đến 3,1%.
Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này có chất
lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus. Tuy mức độ biến đổi thấp giữa các loài khác nhau
nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ,
thảo dược dương xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai
(Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả

Lâm Đồng
C13; C14;
C15
Codonopsis sp.
Mọc hoang, Đa Sal, Lạc Dương,
Lâm Đồng
C16; C17;
C18
Đảng Sâm
Xã Long Hẹ, Huyện Thuận Châu,
Sơn La
C20; C21
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt từ các hãng uy tín đảm bảo về chất
lượng và độ tin cậy như Qiagen, Fermentas, Sigma…

2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: cân điện tử Satorius
XB 200A (Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy đo ph, máy li tâm, máy PCR.
2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản đoạn hai gen đích là gen ITS và gen matK,
trình tự và thông tin về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 5

Bảng 2. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu
Gen
đích

Tên mồi

Trnh tự mồi
900bp

matK-1326r
5’- TCT AGC ACA CGA AAG TCG
AAG T-3’
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Các mẫu thực vật được tách chiết lấy ADN tổng số bằng quy trình mini-CTAB và kit
DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen.
2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết
ADN tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose
1%, trong đệm TBE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được kiểm tra qua phương pháp đo mật độ
quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm. Pha loãng dịch chiết 100 lần (5µl mẫu +
450µl DDW), mỗi mẫu đo ba lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả
cuối cùng. Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số A
260/280
, thông thường A
260/280
=1,6-2.0
được coi là mẫu tinh sạch, nồng độ ADN của mẫu được tính thông qua giá trị
1,0A
260
=50µg/µl.
2.2.3. Phƣơng pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR
Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR 9700.
Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen được tóm tắt ở Bảng 6. Thể tích cụ thể của các
thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 7 và Bảng 8.

Mồi ngược
10pmol
1.0
7
Tag DNA polymerase
1u/µl
0.25
8
ADN khuôn

3
9
Tổng thể tích

25 Bảng 4. Chu trnh nhiệt cho gen ITS
Bước
Nhiệt
độ(
o
C)
Thời gian

Chu
kỳ

C)
Thời gian
Chu
kỳ
Khởi
động
94
60s
1
Biến tính
94
30s

35
Gắn mồi
52
20s
Kéo dài
72
50s
Ổn đinh
72
5p
1
Bảo quản
4
∞ 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trnh tự

C12
1,61
121,5
C13
2,00
170,6
C14
1,96
98,8
C15
2,00
170,6
C16
2,00
229,0
C17
1,95
191,3
C18
1,9
107
C20
1,85
84,5
C21
1,87
81,0

3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR
Kết quả PCR thu được như sau: chúng tôi đã nhân thành công 11/12 mẫu Codonopsis

C. kawakamii trên Genbank với chỉ 4 điểm sai khác (0,46% so với toàn bộ trình tự), các mẫu
nghiên cứu còn lại bao gồm: C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C20, C21 trình tự có
độ tương đồng cao với nhau, trong đó các mẫu C14, C15, C16 có trình tự tương đồng 100%,
các mẫu có trình tự giống nhau đến 99,8% gồm mẫu C18 với các mẫu C12, C14, C15, C16,
và các mẫu có trình tự sai khác nhiều nhất là giữa mẫu C2 và C4, sai khác là 2,6%.
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Cây chủng loại phát sinh cho thấy mẫu nghiên cứu là C4 nằm cùng nhánh với C.
tangshen, với chỉ số bootrap là 65%, còn lại các mẫu đều nằm cùng nhánh với C. javanica
với chỉ số bootstrap rất cao 100%, điều này phù hợp với kết quả phân tích tính đa dạng trong
trình tự vùng gen ITS.

Hnh 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên
khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93
.
Hnh 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên khung đọc
gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93

Cùng với kết quả so sánh trình tự ở trên, có thể xác định các mẫu nghiên cứu: C2,
C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C. javanica, mẫu C4 thuộc
loài C. tangshen
Các mẫu nghiên cứu có phân bố không đổi trên cây phát sinh chủng loại được xây
dựng dựa trên gen matK, với bootrap của nhánh là 98%, bao gồm các mẫu nghiên cứu: C2,
C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21, trong nhóm có sự phân nhánh nhỏ hơn
giữa các mẫu nghiên cứu, có thể nói gen matK có khả năng phân tách tốt hơn gen ITS, và có
thể có các tồn tại dưới loài của loài C. javanica. Mẫu C4 cùng nhánh với C. kawakamii với
bootstrap hơn 80%. Hnh 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp Bayesian trên khung
đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10

Kết luận
Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận chính như sau:
1. Đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích sự đa
hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm
đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK
kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình tự
2. Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự ADN vùng gen ITS có thể xác định các
mẫu nghiên cứu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C.
javanica và mẫu C4 thuộc loài C. tangshen
3. Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo thủ ở loài C.
javanica và C. tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu.
4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên phương pháp Tiết kiệm tối đa
(Maximum Parsimony) và Bayesian dựa trên khung đọc riêng rẽ từng gen ITS và matK cho
kết quả tương đồng, cho thấy độ đáng tin cậy của cây thu được cũng như của 2 phương pháp
MP và Bayesian sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh trong chi Codonopsis. Các
cây phân loại xây dựng được một lần nữa cho kết luận xác định các mẫu nghiên cứu thuộc hai
loài C. javanica (đối với các mẫu C2 thu được ở, C11, C12 thu được ở Kon Tum, mẫu C13,
C14, C15, C16, C17, C18 thu được ở Lạc Dương, Lâm Đồng và các mẫu C20, C21 thu được
ở xã Long Hẹ, Sơn La) và C. tangsheng (đối với các mẫu C4 thu được ở Sa Pa, Lào Cai).
5. Kết quả phân tích trình tự ADN và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết
luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được
sử dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis
6. Nghiên cứu này lần đầu tiên ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di
truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam, và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế
giới khẳng định vùng gen ITS và matK có thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã
vạch phân tử, đồng thời công nghệ này có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến
hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý.

Kiến nghị
1. Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc chi Codonopsis để đánh giá toàn diện hơn

11. B., H.M. (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic
regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8, pp. 513-525.
12. Bailey C. D., C.T.G., Harris S. A., Hughes C. E. (2003), “Characterization of
angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes”, Molecular
Phylogenetics and Evolution, 29, pp. 435-455.
13. Bartlett J, S.D. (2003), “A short history of the polymerase chain reaction”, Humana
Press Inc., pp. 1-6.
14. Bruni I., D.M.F., Galimberti A., Galasso G., Banfi E., Et Al. (2010), “Identification of
poisonous plants by DNA barcoding approach”, International Journal of Legal
Medicine 124, pp. 595-603.
15. Chen F., C.H.Y., Wong K. L. ,Wang J., Yu M. T., but P. P. H., Shaw P. C. and
(2008), “Authentication of Saussurea lappa, an endangered medicinal material, by
ITS DNA and 5S rRNA sequencing.”, Planta Medica, 74, pp. 889–892.
16. Chen S., Y.H., Han J., Liu C., Song J., Et Al. (2010), “Validation of the ITS2 region
as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS ONE 5:
e8613.
17. Chiou S. J., Y.J.H., Fang C. L., Chen H. L., Lin T. Y. (2007), “Authentication of
medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta Medica,
1421-1426.
18. Chun-Feng Qiao, Q B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu and Hong-
Xi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal
DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia”, Journal of Food and Drug
Analysis, 17, pp. 142-145.
19. Cuenoud P., S.V., Chatrou L. W., Et Al. (2002), “Molecular phylogenetics of
Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA
sequences”, American Journal of Botany, 89, pp. 132-144.
20. Dj., C. (2000), “Plant macromolecular systematics in the past 50 years: one view”,
Taxon, 49, pp. 479-501.
21. E., E. (2006), “Herbal medicines-they are popular, but are they also safe?”, Eur J Clin
Pharmacol, 62, pp. 1-2.

of Biogcography, 28, pp. 253-261.
35. Jaakola L., S.M., Haggman H. (2010), “Novel approaches based on DNA barcoding
and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species”,
Food Chemistry, 123, pp. 494-500.
36. Jarman, S.N., Elliott, N. G. (2000), “DNA evidence for morphological àn cryptic
Cenozoic speciations in the Anaspididae, "living fossils" from the Triassic”, J. Evol.
Biol., 13, pp. 624-633.
37. Jhi., C. (2002), “Challenges and opportunities confronting the botanical dietary
supplement industry”, J Nat Prod, 65, pp. 1073-1084.
38. Jones W. P., C.Y W., Kinghorn A. D. (2006), “The role of pharmacognosy in
modern medicine and pharmacy”, Current Drug Targets, 7, pp. 247-264.
39. Karehed J., G.I., Dessein S., Motley T. J., Bremer B. (2008), “The phylogenetic utility
of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny of the Rubiaceae tribe
Spermacoceae”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, pp. 843-866.
40. Kesanakurthi R. P., F.a.J., Burgess K. S., Percy D. M., Newmaster S. G., Et Al.
(2011), “ Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA
barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp. 1289-1302.
41. Koehn Fe, C.G. (2005), “The evolving role of natural products in drug discovery”,
Nat Rev Drug Discov, 4, pp. 206-220.
42. Kojoma M., K.K., Yamada K., Sekita S., Satake M., Iida O. (2002), “Genetic
identification of cinnamon (Cinnamomum spp.) based on the trnL–trnF chloroplast
DNA”, Planta Medica, 68, pp. 94-96.
43. Kress J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding
rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region”, PLoS One, 6, pp.
1-10.
44. Kress, J.W., Wurdack, K . J. ,Zimmer, E. A. ,Weigt, L. A. & Janzen, D. H. (2005),
“Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102,
pp. 8369-8374.
45. Kress W. J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the
coding rbcL gene complements the noncoding trnH–psbA spacer region”, PLoS One,

ChineseTraditional and Herbal Drugs 322, pp. 834-837.
56. Liu Jie, M.M., Gao L-M, Zhang D-Q, Li D-Z (2010), “DNA barcoding for the
discrimination of Eurasian yews (Taxus L., Taxaceae) and the discovery of cryptic
species”, Molecular Ecology Resources, 11, pp. 89–100.
57. M. Sanderson, B.B., G. Bharathan, C. Campbell, D. Ferguson, J. M. Porter, C. V.
Dohlen, M.Wojciechowski, and M. Donoghue. (1993), “The growth of phylogenetic
information and the need for a phylogenetic database.”, Syst. Biol., 42, pp. 562-568.
58. Ma., H. (2001), “Self-medicative behavior in the African great apes: an evolutionary
perspective into the origins of human traditional medicine”, Bioscience, 51, pp. 651-
661.
59. Mark Y. S., H.P.D.N. (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp. 82-88.
60. Miwa H, O.I., Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et Al. (2009), “Adaptive
evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes).”, Gene, 441, pp. 169-
175.
61. Miwa H., O.I.J., Matsui A., Hasegawa M., Akiyama H., Et Al. (2009), “Adaptive
evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441(169-175).
62. Mizukami H., O.K., Kitamura Y., Ikenaga T. (1993), “Restriction fragment length
polymorphism (RFLPs) of medicinal plants and crude drugs.l.RFLP probes allow
clear identification of Duboisia interspecific hybrid genotypes in both fresh and dried
tissues”, Biol Pharm Bull, 16, pp. 388-390.
63. Newman D. J., C.G.M., Snader K. M. (2000), “The influence of natural products upon
drug discovery”, Nat Prod Rep, 17, pp. 215-234.
64. Ogden R., M.H.N., Cowan R. S., Chua L., Groves M., Et Al. (2008), “SNP-based
method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp. timber and products:
applied research meeting CITES enforcement needs”, Endangered Species Research,
9, pp. 255-261.
65. Organization, W.H. Traditional Medicine. 2008 [cited; Fact Sheet N134]. Available
from:
66. Ratnasingham S., H.P.D.N. (2007), “BOLD: the barcode of life data system”, Mol
Ecol Notes, 7, pp. 355-364.

relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK,
rpl20-rps18 spacer, and trnV intron sequences”, American Journal of Botany 86, pp.
1742-1753.
78. Wilson, K.H. (1995), “Molecular biology as a tool for taxonomy”, Clin. Infect. Dí. ,
20, pp. 192-208.
79. Yamaji H., F.T., Yokoyama J., Pak J-H., Zhou C., Yang C. Et Al. (2007), “Reticulate
evolution and phylogeography in Asarum sect. asiasarum (Aristolochiaceae)
documented in internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal
DNA”, Mol Phylogenet Evol, 44, pp. 863-884.
80. Yan P., P.Q.H., Jiao X. W., Zhao X., Shen Y. J., Zhao S. J. (2008), “Genetic variation
and identification of cultivated Fallopia multiflora and ITS wild relatives by using
chloroplast matK and 18S rRNA gene sequences”, Planta Medica, 74(1504-1509).
81. Yang D. Y., F.H., Cai S. Q., Komatsu K. (2004), “Molecular analysis of Rheum
species used as Rhei Rhizoma based on the chloroplast matK gene sequence and ITS
application for identification”, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 27, pp. 375-
383.
82. Yang Z. Y., C.Z., Huo K. K., Xie H., Tian Z. P., Pan S. L. (2007), “ITS sequence
analysis used for molecular identification of the Bupleurum species from northwestern
China”, Phytomedicine, 14, pp. 416-423.
83. Yao H., S.J.Y., Ma X. Y., Liu C., Li Y., Xu H. X., Han J. P., Duan L. S., Chen S. L.
(2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence:
the chloroplast psbA–trnH intergenic region”, Planta Medica, 75, pp. 667-669.
84. Zhang Y., Z.J.C., Huang M. H., Yang M. S., Cao H. (2006), “Detection of genetic
homogeneity of Panax notoginseng cultivars by sequencing nuclear 18S rRNA and
plastid matK genes”, Planta Medica, 72, pp. 860-862.
85. Zhao Z. L., L.C.H., Wang Z. T. (2007), “Identification of Dryopteris crassirhizoma
and the adulterant species based on cpDNA rbcL and translated amino acid
sequences”, Planta Medica, 73, pp. 1230-1233.