i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Thanh Nga

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY
DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM
(Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012
ii
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


truyền…………… 8
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) 11
1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 13
1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật 13
1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật 14
1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật 19
1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung 19
1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu 24
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Vật liệu nghiên cứu 32
2.1.1. Vật liệu thực vật 32
2.1.2. Hóa chất 32
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33
2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 33
2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 34
2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 35
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự 36
2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu 37
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tách chiết ADN tổng số 38
iv
3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 39
3.3. Phân tích kết quả 40
3.3.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu 41
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65


Hình 4. Hoa của các loài (a) C. nervosa (b) C.lanceolata (c) C. ussuriensis 7
Hình 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%,
marker 1kb … 38
Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis
trên gel agarose 1%, marker 100bp 40
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên
gel agarose 1% 40
Hình 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung
đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 58
Hình 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung
đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 59
Hình 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung
đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10
6
thế
hệ……… 60
Hình 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung
đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10
6
thế
hệ…………………………………………………………………………………… 61

vii
BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
ADN
Deoxyribonucleic acid
Axit deoxyribonucleic

1
MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam
hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600
loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo
kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được
3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng
vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây
mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây
thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn
dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công
nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc
mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung
cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao
gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện
nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ
trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này
cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược
liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh
tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng
làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc
điểm hình thái tương tự nhau.
Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8],
[47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất
là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung
các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được
xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ
bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung
Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô

các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự

3
đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên
tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN
từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch
ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa
và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất
cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền
một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần
xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng
cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp
phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chi Codonopsis
Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm. Đây là chi thực vật
hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông. Chi
này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á. Codonopsis được
coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống
Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75].
1.1.1. Phân loại học
Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:
 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)
 Giới: Plantae (Thực vật)
 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có:
- Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này
chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm,
thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có
khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá. Đài 5, Tràng hình
chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm
nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng

6
9 tháng 10. Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây
bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi
là Phòng đảng sâm.
- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng
sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)
còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày),
Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân
leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít
khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông,
đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía
răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá
dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hình 2)
mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng
hoặc hơi vàng, họng có vân tím.

Hình 2. Hoa của loài C. javanica
Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5. Quả nang, màu tím, chứa nhiều hạt hình trái xoan,
màu vàng bóng. Cây mọc hoang ở vùng núi cao, chỗ ẩm mát, nhiều mùn. Có nhiều
ở Hoàng Liên Sơn,Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Tuyên Quang, còn ở Cao Bằng,
Lạng Sơn thì ít hơn, ở các tỉnh phía nam chỉ thấy ở cao nguyên Langbian (Lâm
Đồng), xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Giây-Kon Tum và Quảng Nam- Đà

màu lam nhạt, trong có thới màu tím đậm. Có ở khu tự trị dân tộc Tạng A-pa và
chuyên khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. Hình 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis
lanceolata, và (c) C. ussuriensis.

8
Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hình 4b)
có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hình 4c) có rễ hình củ tròn,
thường được trộn lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc.
Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng
sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc; còn ở phía Nam, chỉ
có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn
La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà
Nẵng và Lâm Đồng [4], [2].
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y
học cổ truyền
Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ. Vào mùa đông,
lúc cây đã úa vàng, rụng lá hoặc tới đầu xuân năm sau lúc cây chưa đâm chồi nảy
lộc là có thể thu hoạch, lúc này phẩm chất Codonopsis tốt nhất, sản lượng cao; đào
rễ phải dài sâu trên 0,7m, vì rễ rất dài, không làm trầy xát. Rửa sạch đất cát, phân
loại rễ to nhỏ để riêng, phơi riêng trên gìan từng loại đến lúc nào rễ bẻ không gãy là
đạt bó từng bó đem phơi Dựa vào chất lượng của rễ sau khi thu hoạch, người ta
chia ra làm 5 loại sau:
- Tây đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi đều tròn, màu vàng hay xám,
thịt rễ có màu ánh vàng, có vân tròn, đường kính từ 13mm trở lên, không lẫn rễ con.
- Đông đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi tròn với ít nếp nhăn, vỏ
màu vàng xám hay nâu xám, thịt màu trắng vàng, thoáng có vân tròn, đường kính từ
10mm trở lên.

ngoại vi và tác dụng ức chế adrenalin của thuốc gây nên.
- Đối với máu và hệ thống tạo máu: dịch chiết cồn và nước sắc Codonopsis
có tác dụng làm tăng số hồng cầu, làm giảm số bạch cầu trong đó lượng bạch cầu
trung tính tăng còn lượng tế bào lâm ba lại giảm. Dịch tiêm Codonopsis làm tăng
nhanh sự đông máu (không có tác dụng tán huyết)[5].
- Đối với điều hòa huyết áp: Tiêm mạch máu dịch Codonopsis 20% (chiết
bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy gây hạ huyết áp, trong

10
khi các lô đối chứng được tiêm 4,8% glucose và dung dịch sinh lý thì không thấy hạ
huyết áp, do đó hiện tượng hạ huyết áp của dịch Codonopsis có lẽ không liên quan
đến thành phần đường của nó. Codonopsis còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao
huyết áp gây ra do adrenalin [5].
- Đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Codonopsis tiêm
bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột đều có tác dụng làm tăng số lượng thực
bào rõ rệt, khả năng thực bào cũng tăng.
- Đối với hệ thần kinh trung ương: cho chuột dùng Codonopsis với liều 6-
7mcg/kg thấy có tác dụng ức chế.
Ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn. Trong mô hình thực
nghiệm „in vitro‟, Codonopsis có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau đối với
não mô cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu, trực khuẩn đại tràng, tụ cầu khuẩn vàng,
trực khuẩn lao ở người. Codonopsis cũng được tìm thấy còn có tác dụng làm hưng
phấn tử cung ở chuột cống, phát triển nội mạc tử cung, gây tăng trương lực cổ tử
cung, tiết sữa ở súc vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương,
nâng cao đường huyết [75].
Trong Y học cổ truyền Việt Nam, Codonopsis được ghi nhận có tác dụng bổ
trung ích khí, sinh tân, dưỡng huyết. Chủ trị chứng huyết hư hoặc khí huyết lưỡng
hư, không có sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang, trị trung khí suy
nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh,
trị thiếu máu mạn, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng, trị hư lao, nội thương,

thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy
nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu
vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống
nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều
điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [36]; ngoài ra, phương
pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện được bởi các chuyên gia hình thái
học; việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [29].
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và

12
được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ
liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng
(protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các
gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen. Trong
phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu
tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây chủng loại
phát sinh cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi.
Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng
loài như sử dụng enzym giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN
(ADN fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, và đặc biệt việc sử dụng các
kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến. Các phương
pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống
nhau và sự khác biệt đặc trưng duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp bazơ.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài.
Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được
dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng
cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm [59]. Trong
công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt

được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu
giữ qua thời gian dài [78]
Chẳng hạn ở các loài linh trưởng, hệ gen mỗi tế bào có khoảng 4 tỷ cặp bp.
Mã vạch gen ty thể CO1 (mã hóa cho tiểu đơn vị của cytochrome oxidase) chỉ có
kích thước 648 bp, nhưng từ người tới tinh tinh và các loài vượn khác, sự khác biệt
của CO1 là vừa đủ để phân biệt giữa mỗi loài. Loài người khác hai loài còn lại ở
một hoặc hai cặp base trong vùng mã vạch, nhưng khác biệt ở cả hệ gen người với
tinh tinh, là khoảng 60 vị trí và với khỉ đột là khoảng 70 vị trí [59]. Đối với công
nghệ mã vạch ADN, hệ gen ti thể cũng tỏ ra đặc biệt phù hợp do sự khác biệt giữa
các loài là nhiều hơn so với DNA hệ gen nhân. Vì đó, một số phân đoạn ngắn ADN

14
ti thể có thể được dùng để phân biệt các loài. Ngoài ra, ADN ti thể thường có nhiều
bản sao hơn so với ADN nhân và vì vậy dễ phục hồi từ các mẫu vật, đặc biệt là từ
các mẫu với lượng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp. Nhiều nghiên cứu đã được
thử nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CO1 trong phân loại các nhóm động vật
đa dạng, phân bố trên đất liền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vùng
nhiệt đới. Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các
loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các
loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài
lai thường xuyên [59]. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome
b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng ở
động vật .
1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật
Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật
[74] và một số loài tảo [68], thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên
cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch. Thay
vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu
phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng
intron của các gen trnL và trnL-F). Những vùng ADN này đủ có ích như mã vạch

khu vực 599 bp ở cuối 5 'của gen, nằm ở bp từ 1-599 trong trình tự hệ gen gen lục
lạp hoàn chỉnh của Arabidopsis thaliana. Khu vực mã vạch matK bao gồm một
vùng khoảng 841 bp ở trung tâm của gen nằm giữa bp 205-1046 (bao gồm cả các
vùng mồi) trong trình tự toàn bộ hệ gen gen lục lạp của A. thaliana. Sự lựa chọn
rbcL + matK như mã vạch lõi được dựa trên sự khuếch đại đơn giản của khu vực
rbcL (rbcL được khuếch đại thành công trong phạm vi rộng bao gồm thực vật có
hoa, thực vật hạt trần và thực vật không có hoa) và khả năng phân biệt của khu vực
matK (MatK là một trong những khu vực mã hóa tiến hóa nhanh nhất của hệ gen
của gen lục lạp [30], và có thể nói là gần tương tự mã vạch CO1 ở động vật). Tuy
nhiên, matK có thể khó khăn để PCR khuếch đại khi sử dụng bộ mồi hiện có - đặc
biệt là khi thực vật nghiên cứu không phải là thực vật hạt kín. Ngược lại, khu vực
mã vạch của rbcL là dễ dàng để khuếch đại, thu trình tự, và so sánh trong hầu hết

16
các thực vật trên đất liền và cung cấp một bộ khung hữu ích cho các dữ liệu mã
vạch, mặc dù nó chỉ có khả năng phân biệt khiêm tốn. Hai dấu chuẩn mã vạch gen
lục lạp phân biệt tốt hơn so với việc sử dụng một dấu chuẩn mã vạch duy nhất,
nhưng không có 2 dấu chuẩn hoặc đa dấu chuẩn gen lục lạp cho độ phân giải tốt
hơn sự kết hợp giữa hai dấu chuẩn rbcL + matK [11]. Khi cả hai dấu chuẩn đều là
vùng mã hóa, sự đọc dịch các trình tự trên ADN thành các axit amin của protein
của gen đó có thể được sử dụng để tự động hóa kiểm tra cho việc chỉnh sửa/lắp ráp
lỗi, sự hiện diện của gen giả, và định hướng đúng trình tự. Ngoài mã vạch rbcL +
matK, dấu chuẩn mã vạch gen lục lạp được sử dụng rộng rãi nhất là trnH-psbA. Ở
hầu hết thực vật có hoa, kích thước vùng này dao động từ 340- 660 bp, dễ dàng
được khuếch đại, và là một trong những vùng liên gen (IGS-intergenic spacer) ở
thực vật [69]. Nó đã được sử dụng thành công trong một loạt các nghiên cứu mã
vạch và là một sự lựa chọn rõ ràng cho một mã vạch bổ sung. Trong những nghiên
cứu so sánh trực tiếp, nó thành công cao hơn trong việc phân biệt loài so với rbcL +
matK ở những nhóm như Ficus và Alnus [67] và giải quyết hoàn thiện các nhóm
phức tạp như Quercus và Salix [76]. Sự hiện diện của những vùng lặp lại có thể dẫn

phức tạp (ví dụ như chất lắng).
1.3.2.2. Các dấu chuẩn vùng gen nhân đƣợc sử dụng rộng rãi
Trình tự ITS bao gồm: ITS1- 5.8S rDNA-ITS 2 với kích thước khác nhau, từ
400 đến hơn 1000 bp. Đây là trình tự được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu
hệ thống phát sinh ở thực vật do nó có khả năng phân biệt loài cao nhất và dễ
khuếch đại [10], [35] và cũng là một sự lựa chọn cho một mã vạch bổ sung ở những
nhóm có thể giải trình tự trực tiếp [28]. Ở một vài thực vật ký sinh với hệ gen lục
lạp bị giảm mạnh, các nrITS có thể đại diện cho các mã vạch duy nhất khả thi hiện
đang có sẵn (mặc dù matK có thể được giữ lại trong một số thực vật dị dưỡng đầy
đủ). Khả năng phân biệt tốt hơn (nói chung) của nrITS so với các vùng gen lục lạp ở
các mức phân loại thấp cũng được thành lập trong hệ thống học phân tử thực vật, và
rõ ràng rằng trong những nhóm mà nrITS hoạt động tốt, nó sẽ thường xuyên được
sử dụng như là một mã vạch DNA.

18
Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng nrITS phân biệt giữa các loài thực vật
chia sẻ haplotype gen lục lạp [67]. Tuy nhiên, có ba mối quan tâm chính về nrITS,
ngăn cản nó là một thành phần cốt lõi của mã vạch cây trồng. Đầu tiên, trong quá
trình tiến hóa, các gen liên quan trong một loài trải qua quá trình trao đổi gen không
hoàn toàn có thể dẫn đến bản sao paralogous (hiện tượng một gen nhân lên và
chiếm các vị trí khác nhau trong cùng một hệ gen) khác nhau trong cá thể [12]. Sự
xuất hiện của bản sao khác nhau này đòi hỏi những phân tích tỉ mỉ, cẩn thận trong
việc xem xét những vùng này có phải là các cơ sở đa hình không, và tệ nhất, các
bản sao khác nhau có thể ngăn cản việc thu hồi các trình tự có thể đọc được. Ngoài
ra, các biến thể khác nhau có thể được thu từ cùng một mẫu đã cho tùy thuộc vào
chiến lược khuếch đại, cặp mồi được sử dụng, và hiệu quả PCR. Một mối quan tâm
thứ hai là nhiễm nấm mốc [10], đặc biệt là trong trường hợp thực vật chứa nấm hội
sinh. Và thứ ba, mặc dù một số bộ mồi nrITS là có sẵn, và đã được sử dụng thành
công trước đó, tuy nhiên vẫn có thể gặp khó khăn trong việc khuếch đại và giải
trình tự khu vực này từ những bộ mẫu có độ đa dạng cao. Ví dụ, Gonzalez và cộng