BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
============»ooa============
TRẦN THỊ KIM THUÝ
XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SELEN
• • •
TRONG THỰC PHẨM b a n g q u a n g PHổ HÂP t h ụ
NGUYÊN TỬ (AAS)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2002 - 2007)
Người hướng dẫn:
ThS. Trần Quang Thuỷ
ThS. Trần Nguyên Hà
Nơi thực hiện:
Viện dinh dưỡng
Bộ môn Hoá phân tích
Thời gian thực hiện:
Tháng 12/2006 - 5/2007
m g à õ ĩò ệ é ị ■:
I* THIr-V ! F \! -
HÀ NỘI, THÁNG 512007 ‘ -
M e i u n d i t
q u ỏ t r ỡ n h t h jù e h i ờ n k h ỏ l u õ n n,ý t ũ i n h n u e I t u ờ i t fl a n ,
q u a n t ỏ m g i ỳ f t i t e a ỳe t l l i e i ỏ a , e ỏ e eỏ i
t ú
n h n i ựờ n p h n g , *30041 ố n th i
phfitn ầợrunjg, tõm DCem nghiờm (JJờ linh cur tn thue phm, (J)lt dinh dừtiớ.
(JJi Lng, k ớ n h ti^en lự ờ i n &õu e , t i ổ ltt l Li e ỏ n t n e h õ n t h n h t i :
ầJhS. ầTpum Quai ầJUuijr 7w/ỡ^ pitũig, /JụL ite thue phm -ầJeunjg, tõm
DCint n h ỡ ờw i ( ) ố l i n h eu t t n th i e p h m , <Vin ( lỡ n h d i
ầJhS. ầJrn QớLuin
3 K -

Danh mục các hình
ĐẶT VÂN ĐỂ 1
Chương 1: TổNG QUAN 3
1.1. NGUYÊN TỐ SELEN 3
1.1.1. Đặc điểm 3
1.1.2. Phân bố của Selen trong tự nhiên 3
1.1.3. Vai trò của Selen đối với cơ thể 5
1.1.4. Độc tính của Selen 7
1.1.5. Nhu cầu Selen của con người 8
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN c ú u VỀ SELEN 9
1.2.1 Trên thế giới 9
1.2.2 Trong nước 9
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SELEN 10
1.3.1. Phương pháp phân tích khối lượng 10
1.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV- VIS 10
1.3.3. Phương pháp huỳnh quang 11
1.3.4. Phương pháp cực phổ 11
1.3.5. Phương pháp kích hoạt phóng xạ 11
1.4. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHổ HẤP t h ụ n g u y ê n t ử 11
1.4.1. Lý thuyết về phương pháp AAS 12
1.4.2. Kỹ thuật hydrid hóa 15
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng 17
1.5. PHƯƠNG PHÁP VÔ Cơ HÓA MAU 17
MỤC LỤC
1.5.1. Phương pháp vô cơ hóa khô 18
1.5.2. Phương pháp vô cơ hóa ướt 18
1.5.3. Phương pháp vô cơ hóa trong lò vi sóng 18
1.5.4. Phương pháp lên men 18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20
2.1. ĐÔÌ TƯỢNG NGHIÊN CÚƯ 20

EDL: Đèn phóng điện không điện cực
Electrodeless Discharge Lamp
ET- A AS: Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa
Electro- Thermal Atomic Absorption Spectrometry
HCL: Đèn catod rỗng
Hollow Cathod Lamp
HVG- A AS: Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử hoá hơi hydrid
Hydrid Vapor Generation
ICP- MS: Plasma cao tần cảm ứng- khối phổ.
Iductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry
LOD: Giới hạn phát hiện
Limit O f Detection
LOQ: Giới hạn định lượng
Limit Of Quantification
NAA: Phươngpháp kích hoạt nơtron
Neutron Activation Analysis
RDA: Liều khuyến cáo hàng ngày
Recommended Daily Allowancges
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối
Relative Standard Deviation
SD: Độ lệch chuẩn
Standard Deviation
USP: Dược điển Mỹ
United StatePharmacopiea
ƯV- VIS: Tử ngoại khả kiến
Ultraviolet- Visible
9
22
22
22


Bảng 3.8: Xác định LOD và LOQ
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát quy trình vô cơ hóa
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đỗ xanh

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đỗ đen

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đậu Hà Lan
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu gạo nếp

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu lạc nhân

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu tỏi
Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu gạo Tạp Giao
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu tỏi

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh
(thêm chuẩn 150 ng seien)
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh
(thêm chuẩn 50 ng seien)
20. Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh
(thêm chuẩn 200 ng selen)
21. Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu gạo nếp
(thêm chuẩn 10 ng selen) 26
22. Bảng 3.22. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu gạo nếp
(thêm chuẩn 100 ng selen) 26
23. Bảng 3.23. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu gạo nếp
(thêm chuẩn 200 ng selen) 3 7
24. Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ acid nitric
37

phương pháp chính xác và tin cậy để xác định hàm lượng selen trong thực phẩm.
Trên thế giới, người ta đã tiến hành phân tích selen trong thực phẩm bằng nhiều
phương pháp khác nhau như đo huỳnh quang, kích hoạt nơtron, HVG- AAS, ET-
AAS hay phương pháp ICP- MS [11], [14], [15], [20], [23].
Kỹ thuật HVG- AAS đang được sử dụng khá rộng rãi vì nó đáp ứng được
các yêu cầu đối với việc xác định chính xác các nguyên tố vi lượng trong các đối
tượng sinh học, dược phẩm, thực phẩm
Ở Việt Nam hiện tại chưa ban hành chính thức các phương pháp phân tích
Selen trong mẫu thực phẩm. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và trang thiết bị sẵn có
của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp
định lượng Selen trong thực phẩm bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử
(AAS)” với 2 mục tiêu sau:
1
1. 'Xây dựng được một phương pháp phân tích selen trong thực phẩm có độ
chính xác, độ tin cậy cao góp phần giúp người tiêu dùng lựa chọn khẩu phẩn ăn
hợp ly cũng như việc kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng selen trong một số
thực phẩm.
2
Chương I: TổNG QUAN
1.1. NGUYÊN TỐ SELEN
1.1.1. Đặc điểm [2], [5], [8], [9], [12], [33]
Tên quốc tế: Selenium.
Kí hiệu hóa học: Se.
Nguyên tử lượng: 78,96.
Số thứ tự : 34.
Thuộc nhóm VIA trong bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố.
Các nguyên tố cùng nhóm với seien: oxy, lưu huỳnh, telu và poloni.
Selen được Berzelius (1779-1848) - nhà hóa học người Thụy Điển tìm ra
năm 1817.

-Nhóm 1 gồm các loại cây ít tập trung selen, đa số thực vật thuộc loại này.
-Nhóm 2 gồm các loài cây tập trung selen ở mức vừa phải, đặc biệt trong
nhóm này lúa mỳ là loại ngũ cốc giàu selen nhất.
-Nhóm 3 gồm các cây có hệ số tập trung selen cao, rất hiếm có thực vật
thuộc nhóm này.
Những cây tập trung selen thường thuộc họ Đậu, họ Cà phê. Đặc biệt trên
thế giới có những cây có hệ số tập trung selen lớn như Morinda reticulata Benth.
(họ Cà phê), cây Neptunia ampỉexicauỉis Benth. (họ Đậu) và cao nhất là những
cây thuộc loài Astragalus.
Trong các loài cây trồng, lúa mỳ có khả năng tập trung nhiều selen hơn cả.
Các loại đậu có hàm lượng selen thấp hơn các loại ngũ cốc.
Các loại rau thường có hàm lượng selen thấp.
Hàm lượng selen trong thực vật cũng phụ thuộc vào độ ẩm của đất. Những
vùng đất ẩm thì hàm lượng selen trong cây thường thấp hơn.
Ngoài ra, selen còn phân bố trong nước với lượng rất ít. Trong thịt và cá,
hàm lượng selen ở vào khoảng từ 0,4 đến 1,5 ụg/g. Selen tập trung nhiều nhất ở
da và gan các loài cá, đặc biệt ở cá ngừ. Vì thế mỡ cá và dầu gan cá có hàm
lượng selen lớn. Các loài động vật khác có lượng selen ít và không ổn định.
4
1.1.3. Vai trò của selen trong cơ thể [2], [4], [8], [10], [12], [13], [18], [33]
Trước đây, selen được coi là nguyên tố có độc tính cao vì trên những vùng
đất giàu selen thường gặp một số bệnh ở súc vật và người như rụng lông, yếu
cơ
Thế nhưng, đến năm 1949, Claton và Bauman đã nhận thấy rằng hàm
lượng selen trong khẩu phần ăn có tác dụng ngăn chặn sự phát triển ung thư ở
chuột. Năm 1971, người ta đã chứng minh được vai trò quan trọng của selen
trong thành phần cấu tạo của glutathion peroxydase.
Ngày nay, selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng giúp cơ thể
phòng chống bệnh tật.
❖ Vai trò của selen trong chống oxy hóa

nên ngăn chặn quá trình tạo các mảng xơ vữa động mạch- nguyên nhân gây cao
huyết áp, thiếu máu cục bộ ở các cơ quan, thiểu năng tuần hoàn não. Vào đầu
những năm 30, ở Trung Quốc, người ta phát hiện ra bệnh Keshan xảy ra ở những
đứa trẻ có khẩu phần ăn thiếu hụt selen trầm trọng (ít hơn 19 |ig/ngày đối với
nam và 13 Ịig/ngày đối với nữ). Nét đặc trưng của bệnh Keshan là hoại tử nhiều ở
cơ tim.
Ngoài ra, selen còn có tác dụng hạ huyết áp và góp phần bảo vệ sự toàn
vẹn của collagen là điều kiện cần thiết để phòng tránh các bệnh tim mạch.
❖ Selen và quá trình viêm
Có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng selen làm giảm viêm một cách rõ rệt,
đặc biệt là Na2Se. Selen có tác dụng chống viêm do nó có thể làm ổn định
lysosom. Màng lysosom không nguyên vẹn là nguyên nhân của quá trình viêm.
Tác dụng chống viêm của selen tăng lên khi phối hợp cùng với vitamin E.
❖ Selen và hệ thống miễn dịch
Selen có vai trò quan trọng đối với cơ thể trong việc phòng chống các bệnh
nhiễm khuẩn, nhiễm virut kể cả HIV/AIDS. Sự thiếu hụt selen làm giảm khả
năng thực bào, giảm lượng và hoạt tính của tế bào lympho T do đó làm giảm sự
nhạy cảm của cơ thể đối với các tác nhân này. Theo nghiên cứu của các nhà khoa
6
[
học trường Đại học Miami (Mỹ) cho biết những bệnh nhân HIV dùng 200 |ig
seien mỗi ngày có thể giảm được trung bình 12% lượng virut này trong máu. Sự
thiếu hụt seien làm cho nhiều loại virut lành tính trở nên có độc lực (ví dụ virut
Coxsackie B3).
❖ Selen và sự lão hóa
Gốc íự do làm sai lệch cấu trúc và rối loạn thông tin trên nhữĩig phân tử
sinh học, vật chất di truyền và tế bào. Gốc tự do chính là nguyên nhân của sự lão
hóa.
Các hợp chất của seien và co- enzym Q có khả năng chống oxy hóa các
lipid ở màng tế bào, phân hủy các peroxyđ đã tạo thành trong tế bào, đảm bảo sự

dạ dày ruột, rối loạn thần kinh, suy hô hấp và suy thận. Ngộ độc mạn tính selen
được mô tả
ở hầu hết bệnh nhân là thay đổi cấu trúc móng, rụng lông tóc. Nếu
tiếp tục ăn vào với liều cao sẽ gây tổn thương da, hệ thần kinh, ỉa chảy, hỏng
răng. Những triệu chứng này xuất hiện khi dùng 3200 đến 6700 |ig selen/ngày. Ở
Mỹ, người ta coi liều 500 Ịig/ngày dùng trong thời gian dài là có nguy cơ ngộ độc
cho người.
1.1.5. Nhu cầu Selen của con người [4], [8], [12], [21]
Selen tham gia vào khẩu phần ăn của con người thông qua thức ăn và nước
uống. Ở hàm lượng hợp lý selen có tác dụng rất tốt trong phòng ngừa bệnh tật
nhưng nếu thừa sẽ gây ra độc tính. Vì vậy, việc quy định về hàm lượng selen ăn
vào hàng ngày cũng được nhiều quốc gia quan tâm. Năm 1980, các nhà khoa học
Mỹ đã xác định hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày của người
lớn là 50- 200 |ig. Ở Australia liều khuyên dùng đối với người trưởng thành là 85
|ig/ngày đối với nam và 70 ịig/ngày đối với nữ.
Theo khuyến cáo của Viện Y học Mỹ, lượng selen ăn vào hàng ngày
(RDA) đối với trẻ em và người lớn như sau :
8
Bảng 1.1: Lượng Selen ăn vào hàng ngày theo khuyến cáo của Viện Y học
Mỹ
Lứa tuổi
Nam và Nữ
(ng/ngày)
Phụ nữ mang
thai
(ng/ngày)
Phụ nữ đang
cho con bú
(ng/ngày)
Mức tối đa

19 tuổi trở lên
55
60
70
400
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN cứ u VỂ SELEN
1.2.1. Trên thế giới
Năm 1998, Atsuko Shinohara và Momoko Chiba đã dùng phương pháp
khối phổ Plasma cảm ứng vi sóng để định lượng seien trong huyết tương máu
người.
Năm 1999, Marijana Matex, Maja Blausa và Jerica Grgic nghiên cứu xác
định seien trong một số thực phẩm như thịt, cá, trứng, sữa bằng phép đo phổ
hấp thụ nguyên tử.
Năm 2002, Han Wen Sun, Jing Ha, De Qiang Zhang, Li Li Yang và Jian
Min Sun đã xây dựng phương pháp để định lượng vết seien trong nước tiểu bằng
phổ hấp thụ dẫn xuất hydrid.
1.2.2. Trong nước
ở Việt Nam, vấn đề về seien bắt đầu được quan tâm, nghiên cứu nhiều từ
đầu những năm 90 của thế kỷ trước.
9
Năm 1991, Bùi Mai Hương đã nghiên cứu định lượng vết selen và telu
bằng một số phương pháp cực phổ hiện đại.
Năm 1997, Lê Thị Hương Giang (Trường Đại học Tổng hợp) nghiên cứu
xác định selen bằng phương pháp cực phổ xung vi phân và Volt- ampe hòa tan.
Năm 2001, Ngô Văn Tuyên nghiên cứu định lượng selen trong nấm men
bằng hệ máy phân lích MS-750.
Năm 2002, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường công bố công trình nghiên cứu
sản xuất nấm men giàu selen ở quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng phương
pháp định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-
vistheo ƯSP24.

1.3.4. Phương pháp cực phổ [8], [11], [12], [15]
Nguyên tắc: Đưa selen trong mẫu về Se(IV) rồi thực hiện cực phổ giọt
thủy ngân với dung dịch điện ly nền acid. Dưới thế 0-100mV, selen bị khử ở
catod cho 2 thế bán sóng. Đo cường độ dòng khuếch tán giới hạn tại thế bán sóng
thứ hai sẽ xác định được nồng độ selen trong dung dịch đo.
1.3.5. Phương pháp kích hoạt phóng xạ [14]
Nguyên tắc: Selen được chuyển về các đồng vị do bắn phá mẫu bằng
chùm nơtron, sau đó đo các cường độ bức xạ của đồng vị mới tạo thành.
Độ nhạy của phương pháp này đạt được 0,01 Ịig tuy nhiên phương pháp
này đòi hỏi phải có thiết bị phức tạp và phương tiện chống nhiễm xạ.
1.4. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (AAS) [1],
[6], [7], [8], [26], [27]
Năm 1802, Wollaston lần đầu tiên công bố về hiệu ứng hấp thụ nguyên tử
sau khi quan sát thấy những vạch tối trong phổ ánh sáng mặt trời. Năm 1961,
người ta bắt đầu sản xuất hàng loạt phổ kế hấp thụ nguyên tử có ứng dụng phân
tích.
Trong ngành phân tích thực phẩm, phương pháp AAS cũng được ứng dụng
khá nhiều để xác định hàm lượng các nguyên tố trong các mẫu rau quả, thịt, cá.
11
Phương pháp AAS có độ nhạy, độ chính xác cao nên chúng tôi sẽ ứng
dụng phương pháp này để xác định hàm lượng selen trong thực phẩm- một
nguyên liệu mà hàm lượng selen rất ít và có nhiều tạp chất.
1.4.1. Lý thuyết về phương pháp AAS
Như chúng ta đã biết, vật chất được cấu tạo bởi các nguyên tử. Trong điều
kiện bình thường nguyên tử không thu cũng không phát ra năng lượng dưới dạng
các 'bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, bền vững và nghèo
năng lượng nhất. Khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu chiếu một chùm tia
sáng có những bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì chúng sẽ hấp
thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có
thể tạo ra trong quá trình phát xạ của nó. Lúc này nguyên tử nhận năng lượng và

đèn catod rỗng (HCL- Hollow Cathode Lamp), đèn phóng điện không điện cực
(EDL- Electrodeless Discharge Lamp) hoặc nguồn phát bức xạ liên tục đã được
biến điệu.
- Phần 2: Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích: được thực hiện theo hai
kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu.
+ Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa: bao gồm bộ phận dẫn mẫu vào buồng
aerosol hóa và đèn để nguyên tử hóa mẫu (burner head).
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa: gồm một lò nung nhỏ bằng
graphit (cuvet graphit) hay thuyền tangtan (Ta) để nguyên tử hóa mẫu nhờ nguồn
năng lượng điện có thế thấp (nhỏ hơn 12V) nhưng có dòng rất cao (50-800 A).
- Phần 3: Hệ thống máy quang phổ hấp thụ, bộ đom sắc có nhiệm vụ thu,
tán sắc và chọn tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát
tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ.
- Phần 4: Là hệ thống chỉ thị tín hiệu hấp thụ của vạch phổ, thường chỉ thị
hấp thụ năng lượng bằng:
+ Thang đo mật độ quang.
+ Phương pháp hiệu số chỉ độ hấp thụ của vạch phổ.
+ Ghi cường độ vạch phổ ở dạng pic.
+ Phương pháp in trực tiếp giá trị đo.
❖ Cường độ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử
13
Cường độ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử và nồng độ của nguyên tố đó
trong đám hơi tuân theo định luật Lambert -Beer. Chiếu chùm tia sáng đơn sắc
cường độ I0 đi qua môi trường chứa nguyên tử tự do có nồng độ N và bề dày L.
Gọi D là cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử ta có:
D = log Io/I = 2,303. KV.N.L (1.1)
Trong đó:
I0: Cường độ chùm sáng tới.
I: Cường độ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ.
D: Cường độ hấp thụ của một vạch phổ.

hấp thụ nguyên tử nên quá trình nguyên tử hóa mẫu sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết
quả phân tích.
ở đây, chúng tôi dùng kỹ thuật hydrid hóa để chuyển nguyên tố cần phân
tích về dạng hydrid rồi mới nguyên tử hóa.
Nguyên tắc: Trong những điều kiện nhất định, một số nguyên tố có khả
năng phản ứng với hydro mới sinh hoặc chất khử sinh ra hợp chất hydrid ở trạng
15
thái khí. Các hợp chất này dễ bị nguyên tử hóa thành các nguyên tử tự do có khả
năng hấp thụ quang sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.
Các hợp chất này có nhiệt độ phân hủy rất thấp: HgH2 ở 20°C; AsH3,TeH4
SeH4 ở 700°C; AsH5, TeH6, SeH6 ở 850°c.
Sau khi các hợp chất hydrid đã được hình thành trong bình phản ứng, dùng
khí trơ argon dẫn vào cuvet thạch anh để nguyên tử hóa và đo phổ.
Các phản ứng tạo hợp chấí hydrid:
• Với Hg (II): Hg(II) + NaBH4 + H+ -ỳ HgH2 Hg(k).
Hg(II) + SnCl2 + H+ ^ Hg(k).
• Vói As (III): As(III) + NaBH4 + H+ -ỳ AsH3 -> As(k).
• Với As (V): As(V) + NaBH4 + H+ -ỳ AsH5 -ỳ As(k).
• Với Se (IV): Se(IV) + NaBH4 + H+ -ỳ SeH4 -ỳ Se(k).
• Với Se (VI): Se(VI) + NaBH4 + H+ SeH6 Se(k).
Ở đây phản ứng của ion hóa trị cao với hydro mới sinh thường rất chậm
nên phải khử trước As (V) về As (ni), Se (VI) về Se (IV) và Te(VI) về Te(IV) rồi
mới tiến hành phản ứng như vậy kết quả sẽ ổn định hơn.
Trang bị của kỹ thuật hydrìd'. gồm có các bộ phận sau
- Bình phản ứng.
- Bộ bơm mẫu và thuốc thử.
- Bộ lọc và làm khô khí hydrid.
- Cuvet thạch anh.
- Nguồn nhiệt để nguyên tử hóa hợp chất hydrid có thể dùng:
• Ngọn lửa đèn khí (không khí + acetylen) của hệ AAS.