m
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THU
XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
• • •
Mo TRONG DƯỢC LIỆU BANG p h ư ơ n g p h á p
QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2002-2007)
Người hướng dẫn: PGS.TS. PHAN TUÝ
TS. LÊ THỊ KIỂU NHI
Nơi thực hiện : VIỆN KIỂM NGHIỆM - BỘ Y TÊ
BỘ MÔN HOÁ ĐẠI CƯƠNG -VÔ c ơ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
Thòi gian thực hiện: 27/2/2007 - 31/5/2007
\ c
Hà Nội, 5-2007
m
m
LỜ3 cảm 0®
Sau ba tháng thực hiện khóa luận, nhờ sự hướng dẫn tận tình của các
thầy cô giáo cùng với sự giúp đỡ mọi mặt của toàn thể cán bộ, nhân viên
phòng Mỹ Phẩm - Viện Kiểm nghiệm, em đã hoàn thành mục đích và nội
dung đề ra của khóa luận trong thời gian quy định.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo:
PGS.TS. Phan Túy
TS. Lê Thị Kiều Nhi
những người đã tin tưởng giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp.
Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ của
cô ThS. Lê Thị Hường Hoa, trưởng phòng Mỹ Phẩm cùng toàn thể cán bộ,

-9-
1.3.2. Phương pháp động học xúc tác 10-
1.3.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

-10-
1.4. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

-11-
1.4.1. Đối tượng và phạm vi ứng dụng của AAS

-11-
1.4.2. Cơ sở lý thuyết và trang bị của phương pháp AAS 11-
1 .4.3. Kỹ thuật nguyên tử hoá

-16-
1.4.4. Phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích

-17-
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19-
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp 19-
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu 19-
2.1.2. Mẫu chuẩn -19-
2.1.3. Trang thiết bị và hoá chất 19-
2.1.4. Nội dung nghiên cứu
-20-
2.1.5. Phương pháp nghiên cứu -21-
2.1.6 . Phương pháp xử lý số liệu 21-
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 23-
2.2.1. Xác định độ ẩm của dược liệu 23-
2.2.2. Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Mo

(ppm/khối lượng khô)
3. Bảng 3: Hàm lượng Mo trong các loài động vật
4. Bảng 4: Lòi khuyên chế độ cung cấp Molybdenum
5. Bảng 5: Kết quả đo độ ẩm trong các mẫu dược liệu.
6 . Bảng 6 : Các thông số máy áp dụng để đo hàm lượng Mo.
7. Bảng 7: Chương trình nhiệt độ được áp dụng.
8 . Bảng 8 : Hàm lượng Mo đo khi thay đổi VHNO , giữ nguyên VHCI0 .
9. Bảng 9'. Ham liTỢQ|ị Mo khi thciy đoi Vjjqq^ ) §111 n§uycn Vỵf]Q^.
10. Bảng 10: Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng.
11. Bảng 11: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu Hoàng Cầm
(phương pháp đường chuẩn).
12. Bảng 12: Kết quả đánh giá độ thu hồi trên mẫu Hoàng Cầm.
13. Bảng 13: Kết quả Mo đo được bằng phương pháp đường chuẩn.
14. Bảng 14: Kết quả Mo đo được bằng phương pháp thêm đường chuẩn.
15. Bảng 15: So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm
đường chuẩn.
16. Bảng 16: Tên khoa học, nhóm tác dụng dược lý của các vị dược liệu.
17. Bảng 17: Kết quả định lượng Mo trên 20 mẫu dược liệu.
DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Cấu hình hệ thống loại máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Hitachi
Z-5000.
Phụ lục 2: Hệ thống quang học của loại máy Hitachi Z-5000.
Phụ lục 3: Điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Mo bằng phương pháp
ETA - AAS.
Phụ lục 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của nguyên tố Mo
(phương pháp ETA - AAS).
Phụ lục 5: Kết quả khảo sát tỷ lệ acid phù hợp để vô cơ hóa ướt.
Phụ lục 6
:
Kết quả khảo sát độ thu hồi Mo của quy trình vô cơ hóa ướt

Quang phổ hấp thụ nguyên tử” với mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình định lượng Mo trong dược liệu.
- Định lượng được hàm lượng Mo trong một số dược liệu
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về nguyên tố vỉ lượng sinh học [5],[6],[9],[10],[12].
Nguyên tố vi lượng sinh học thuộc hệ các chất hoạt hoá sinh học.
Chúng tham gia các quá trình chuyển hoá, đồng xúc tác các phản ứng sinh hoá
trong cơ thể con người, tham gia vào thành phần cấu tạo các enzyme, protein.
Có nhiều khái niệm về nguyên tố vi lượng sinh học. Tuy nhiên chúng ta
có thể hiểu: nguyên tố vi lượng sinh học là những chất dinh dưỡng vô cơ (kim
loại và phi kim loại), chúng thiết yếu cho sự phát triển bình thường của cơ thể
người và động vật, nhưng chỉ với hàm lượng rất nhỏ, khoảng 10'2 - 10'3 % khối
lượng khô của cơ thể [5],[6 ],[1 0 ].
Từ thập kỉ 60 của thế kỉ XX, nhờ xuất hiện ngành hoá học mới- sinh
hoá vô cơ - có nhiệm vụ chính là làm rõ chức năng sinh học của các kim loại ở
mức độ nguyên tử, phân tử, các nhà sinh hoá đã dựa vào những yếu tố sống
còn của 1 nguyên tố giúp phát triển hoặc làm suy yếu cơ thể mà chia nguyên
tố vi lượng thành 3 nhóm cơ bản: nhóm tối cần thiết, nhóm có thể cần và
nhóm độc tố [9 ], [1 0 ].
Tất cả các nguyên tố vi lượng khi vào cơ thể đều phải tồn tại dưới dạng
phức chất, không được tồn tại dưới dạng ion tự do thì mới có tác dụng và
không gây độc cho cơ thể. Chúng có thể liên kết rất bền hoặc lỏng lẻo với các
phân tử hữu cơ, đây chính là những dạng trung gian để các nguyên tố vi lượng
được vận chuyển, phát huy tác dụng và giảm độc tính xuống tối thiểu. Hàm
lượng của mỗi nguyên tố vi lượng trong cơ thể rất khác nhau, nó phụ thuộc
vào nhu cầu của cơ thể và lượng dự trữ trong các mô. Do có hàm lượng rất nhỏ
trong cơ thể, lại phân bố ở nhiều cơ quan khác nhau nên việc xác định hàm
lượng của mỗi nguyên tố rất khó khăn. Chỉ khoảng 20 năm gần đây nhờ áp
dụng những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nhà nghiên cứu mới tìm ra
được một vài phương pháp định lượng với sai số có thể chấp nhận được

Đức
29
Khoai tây Canada 20-180
USA
30
Singapo 31
Xúp lơ Thụy Sỹ 2260
Czechoslovakia 1150
Đậu đũa Đức
1 0 0 0
Nga 6030
USA
4800
Chè Singapo 2 1 0
Cà chua Singapo
38
Đối với các cơ quan động vật, qua các kết quả nghiên cứu cũng thu
được hàm lượng Mo khác nhau tùy thuộc vào từng cơ quan và từng động vật.
Trong mô động vật, gan, thận và tỳ chứa nhiều Mo hơn cả. Cơ thể người có từ
5-10 mg Mo, tập trung nhiều ở gan, thận rồi tới các tế bào mỡ, các tuyến
thượng thận và xương, phổi, lá lách. Các cơ bắp và não cũng có nhưng ít [27].
Theo kết quả đựơc nêu trong bảng 2 và bảng 3 sau đây, ta thấy với mỗi
loài động vật thì Mo có nhiều trong gan, thận và tỳ, còn nếu so sánh các loài
động vật khác nhau thì động vật thân mềm có hàm lượng Mo cao nhất.
Bảng 2: Kết quả nghiên cứu hàm lượng Mo trong các cơ quan động vật
(ppm/khối lượng khô) [28]
Động vật Não Thận Gan
Phổi Cơ
Tỳ
Chuột 0,24 1,0

Tùy theo từng đối tượng, thể trạng cơ thể và lứa tuổi mà có nhu cầu Mo
hàng ngày khác nhau [1 0 ].
Lượng Mo thường được các bác sĩ chỉ định cho các đối tượng cần được
bổ sung như sau:
-5 -
Bảng 4: Lời khuyên chế độ cung cấp Molybdenum [27].
Đối tượng Tuổi
Nhu cầu hàng ngày
Og/ngày)
Trẻ sơ sinh 0 - 6 tháng 2
Trẻ sơ sinh
7-12 tháng 3
Trẻ nhỏ 1-3 tuổi
17
Trẻ nhỏ
4-8 tuổi 22
Trẻ nhỏ 9-13 tuổi
34
Thanh thiếu niên
14-18 tuổi
43
Người trưởng thành
Trên 19 tuổi
45
Phụ nữ có thai Mọi lứa tuổi
50
Phụ nữ cho con bú
Mọi lứa tuổi
50
Những người cần được bổ sung thêm Mo gồm: người bị các chứng bệnh

một số phân tử vào trong hợp chất acid nucleic. Không có xanthine
oxydase kéo theo sự phân hủy rất nhanh thận do tích lũy nhiều hợp chất
độc.
+ Sulfite oxydase: có trong ty lạp thể, xúc tác chuyển hoá 2 acid
amin chứa lưu huỳnh(S) là methionin và cystein, hoạt tính của nó rất
cần thiết đối vói ruột và phổi.
+ Aldehyde oxydase: có chủ yếu trong gan, ở đó nó có thể phân
huỷ một số phân tử gây độc cho cơ thể.
Tồn tại mối liên hệ giữa sự thiếu Mo và xuất hiện một số bệnh ung thư
ở Trung Quốc, thường là ung thư thực quản, dạ dày. Theo một nghiên cứu mới
đây [27], Mo có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư thực quản, dạ dày. Vùng
Linxian ở phía bắc Trung Quốc là vùng có tỷ lệ người mắc bệnh ung thư thực
quản và dạ dày khá cao (lớn hơn 10 lần so vói các vung khác ở Trung Quốc và
gấp 100 lần so vối Mĩ ). Đất đai ở vùng này chứa rất ít Mo và các nguyên tố
khoáng khác, do đó Mo được cung cấp vào cơ thể người rất thấp. Việc này
làm tăng cao hàm lượng nitrosamine - được biết đến như một chất làm phát
sinh bệnh ung thư, và được coi như một trong những nguyên nhân làm tăng
cao bệnh ung thư dạ dày, thực quản ở người dân vùng này. Thực vật có nhiệm
vụ cung cấp Mo cho quá trình tổng hợp enzym nitrat reducíase - là loại enzym
cần thiết cho sự biến đổi nitrat thành amino acid. Nhưng khi nồng độ Mo
trong đất thấp, thực vật ưu tiên chuyển nitrat thành nitrosamine thay vì sử
dụng nitrat để tổng hợp amino acid. Như vậy, nếu cung cấp Mo cho đất dưới
dạng amonium molybdenate có thể làm giảm nguy cơ ung thư dạ dày, thực
quản bằng cách kìm hãm khả năng gây bệnh của nitrosamine.
Cũng theo một nghiên cứu [17], người ta thấy rằng Mo có vai trò làm
giảm tác dụng của acetaminophen bằng cách làm giảm đi các gốc sulfate của
acetaminophen sulfate. Theo nghiên cứu này, vói hàm lượng Mo 7,5mmol/kg
có thể làm giảm đến 50,65,62,81% tác dụng của gốc sulfate khi sử dụng
acetaminophen với các liều tương ứng lần lượt là 0 ,1 ; 0,3; 1 và 3 mmol/kg.
Như vậy, Mo có thể làm giảm tác dụng của gốc sulfate đi rất nhiều lần so với

chuẩn, tính giá trị mật độ quang của mẫu kiểm tra từ mật độ quang đo được
của mẫu nước đem thử.
Hàm lượng Mo (X) tính bằng mg/1 theo công thức:
Y_ C.1000
~ F.1000
trong đó:
c là hàm lượng Mo tìm được theo thang tiêu chuẩn hoặc theo đồ
thị chuẩn, tính bằng |j,g.
V là thể tích nước lấy để thử, tính bằng ml.
1.3.2. Phương pháp động học xúc tác [14].
Dựa trên phản ứng oxy hoá I~ bằng H20 2 trong môi trường acid được
xúc tác bởi vi lượng Mo(VI) có thể xác định được Mo với hàm lượng cỡ |Lig/ml
mà không cẩn tách loại hoặc làm giàu. Việc xác định Mo có thể tiến hành
theo phương pháp trắc quang dựa trên việc đo sự biến thiên mật độ quang
dung dịch I2 - hồ tinh bột theo thời gian hay kết hợp với phương pháp FIA đo
chiều cao pic với detecto quang UV-VIS.
Nguyên tắc: Việc xác định Mo(VI) dựa trên khả năng xúc tác cho phản
ứng chỉ thị: 27" + H202 + 2H+ -» /2 + H20
Khi có mặt hồ tinh bột, I2 sẽ tạo thành phức màu xanh có cực đại hấp
thụ À,=585 nm. Trên hệ FIA, nếu cố định chiều dài vòng phản ứng, chiều dài
đường ống dẫn, thì sau một khoảng thời gian nhất định sẽ xuất hiện pic
tương ứng. Việc thay đổi nồng độ các tác nhân phản ứng sẽ làm thay đổi tốc
độ cả phản ứng xúc tác và không xúc tác. Tuy nhiên bằng cách điều chỉnh mật
độ quang khi không có mặt Mo(VI) (phản ứng không xúc tác) về giá trị A = 0
( đường nền) sẽ thu được giá trị AA. Trên máy sẽ ghi được chiều cao pic tương
ứng.
1.3.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [24],[25].
Phương pháp này có ưu điểm là giới hạn nồng độ phát hiện được tới 10'6
g/ml ( kỹ thuật F-AAS); 10'9 g/ml (kỹ thuật ETA-AAS). Tuy nhiên thiết bị của
phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử rất tinh vi, hiện đại, đòi hỏi phải có

chất đặc trưng của nguyên tử ở trạng thái hơi. Quá trình đó được gọi là quá
trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hoi và tạo ra phổ
nguyên tử của nguyên tố đó. Phổ sinh ra trong quá trình này được gọi là phổ
hấp thụ nguyên tử. Quá trình hấp thụ chỉ xảy ra với các vạch phổ nhạy, các
vạch phổ đặc trưng và các vạch phổ cuối cùng của các nguyên tố. Muốn có
phổ hấp thụ nguyên tử, trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do, và
sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bước sóng nhất định ứng
đúng với các tia phát xạ nhạy của yếu tố cần nghiên cứu.
1.4.2.2.Phương trình cơ bản của phép đo AAS [2],[4],[7].
Theo định luật Lambe Bear, nếu chiếu một chùm sáng cường độ ban
đầu là I0 qua đám hơi nguyên tử tự do của nguyên tố phân tích nồng độ là N và
bề dày L cm, thì cường độ chùm sáng I sau khi đi qua môi trường hấp thụ
được tính theo:
I = I0.e -^N-L) (1)
Trong đó:
Kv là hệ số hấp thụ nguyên tử của vạch phổ tần số V và là đặc
trưng riêng cho từng vạch phổ của mỗi nguyên tố.
N là nồng độ ( số nguyên tử tự do ).
L là bề dày của lớp hấp phụ.
Nếu gọi Ax là cường độ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử, từ công thức
(
1
) chúng ta có :
Á A = l°g-y- - 2,303.K0.N.L (2)
Ở đây A chính là độ tắt nguyên tử của chùm tia sáng cường độ I
0
sau
khi qua môi trường hấp thụ. A phụ thuộc vào nồng độ nguyên tử N trong môi
trường hấp thụ và phụ thuộc cả vào bề dày L của lớp hấp thụ (bề dày chùm
sáng đi qua). Nhưng trong máy đo phổ hấp thụ nguyên tử thì chiều dài của đèn

công thức:
N = Ka.Cb (5)
Trong đó:
Ka là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào tất cả các điều kiện hóa hơi
và nguyên tử hoá mẫu.
b là hằng số bản chất, phụ thuộc vào từng vạch phổ của từng nguyên tố.
b có giá trị bằng 1 và nhỏ hơn 1 , tức là 0 < b <= 1 , nghĩa là ứng với mỗi vạch
phổ của mỗi nguyên tố phân tích, ta luôn tìm được một giá trị c = C0 để b bắt
đầu nhỏ hơn 1. Nghĩa là ứng với:
Vùng nồng độ Cx < C0 thì luôn luôn có b = 1, nghĩa là mối quan hệ giữa
A và nồng độ Cx là tuyến tính.
Vùng nồng độ Cx > C0 thì b luôn luôn nhỏ hơn 1, tức là b tiến về 0. Như
vậy trong vùng này mối quan hệ giữa A và Cx là không tuyến tính.
Kết hợp (3) và (5) ta có:
Áx = a.cb (6)
Trong đó a = K.Ka và được gọi là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào
tất cả các điều kiện thực nghiệm để hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu
Phương trình (6 ) được gọi là phương trình cơ sở của phép đo định lượng
các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
1.4.2.3.Trang bị của phép đo AAS [2],[4].
Muốn thực hiện phép đo AAS, hệ thống máy đo phổ hấp thụ nguyên tử
phải bao gồm các phần cơ bản sau:
Phần 1: Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố phân tích
(vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích), để chiếu vào môi
trường hấp thụ chứa các nguyên tử tự do của nguyên tố. Đó là các đèn catot
rỗng(HCL), các đèn phóng điện không điện cực (EDL), hay nguồn phát bức
xạ liên tục đã được biến điệu.
Phần 2: Hệ thống nguyên tử hoá mẫu phân tích. Hệ thống này được chế
tạo theo hai loại kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu. Đó là kỹ thuật nguyên tử hoá
bằng ngọn lửa đèn khí (lúc này ta có phép đo F-AAS) và kỹ thuật nguyên tử

- Nguyên tử hoá không ngọn lửa.
Mẫu phân tích được đặt trong cuvet graphit hay trong thuyền Ta và
được nung nóng nhờ nguồn năng lượng nhiệt điện để sấy khô mẫu, tro hoá
luyện mẫu và sau đó nguyên tử hoá mẫu để đo tín hiệu hấp thụ của vạch phổ.
Phương pháp này cung cấp cho phép đo AAS có độ nhạy khá cao cỡ
ng/ml, nguyên tử hoá được nhiều nguyên tố hơn kỹ thuật đo ngọn lửa, tốn ít
mẫu. Quá trình thực hiện trong môi trường khí trơ Argon. Quá trình nguyên tử
hóa xảy ra theo 3 giai đoạn chính: sấy mẫu, tro hoá luyện mẫu, nguyên tử hoá
mẫu để đo tín hiệu hấp thụ AAS. Hai giai đoạn phụ là: làm sạch cuvet và làm
nguội cuvet.
Trong luận văn này, do Mo có hàm lượng nhỏ nên chúng tôi sử dụng kỹ
thuật hấp thụ không ngọn lửa.
1.4.4. Phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích [4],[9],[11].
Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đối tượng mẫu, điều kiện
trang bị kỹ thuật mà ta có các phương pháp xử lý mẫu thích hợp. Với mẫu
thực vật để định lượng vi lượng kim loại, hiện nay thường sử dụng các phương
pháp vô cơ hoá mẫu sau:
1.4.4.1. Phương pháp vô cơ hoá khô.
Nguyên tắc: Đốt cháy các hợp chất hữu cơ có trong mẫu phân tích để
giải phóng kim loại ra dưói dạng oxit hoặc muối của chúng bằng nhiệt, sau đó
hoà tan bằng các acid thích hợp.
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, triệt để nhưng lại có nhược
điểm chính là làm mất các nguyên tố dễ bay hơi như: Hg, Pb, As, và không
áp dụng được cho các nguyên tố có áp suất hoi cao như As, Hg, Cd, , thời
gian xử lý mẫu kéo dài.
Để khắc phục người ta thường cho thêm chất bảo vệ như Mg(N03)2,
KN03 và chọn nhiệt độ thích hợp.
1.4.4.2.Phương pháp vô cơ hoá ướt.
Nguyên tắc: Oxi hoá các chất hữu cơ bằng acid hoặc hỗn hợp acid có
tính oxi hoá mạnh (ví dụ H2S04, HN03, HCIO4).