TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===***===

LÙ THỊ DUYÊN

SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA,
PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84
TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI
SAU NHIỄM MẶN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI - 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===***===

LÙ THỊ DUYÊN

SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA,
PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84
TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI
SAU NHIỄM MẶN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN VĂN MÃ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn
Bảng 2: Hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi
Bảng 3: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn
Bảng 4: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi
Bảng 5: Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Bảng 6: Chiều dài mầm


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn
Hình 3.2. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi
Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn
Hình 3.4. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của mặn đến tỷ lệ nảy mầm
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của mặn đến sự sinh trƣởng của mầm


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................Error! Bookmark not defined.
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................. 3
NỘI DUNG ................................................................................................ 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................... 4
1.1. Sự nảy mầm và đặc điểm sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng. ................. 4
1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật. ....................................................... 5

3.3.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương. ...................................... 22
3.3.2. Sự sinh trưởng chiều dài mầm đậu tương ................................... 24
KẾT LUẬN.............................................................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây đậu tƣơng (Glicine max L.Merrill) là loài cây họ Đậu (Fabaceae),
có nguồn gốc từ Châu Á và đƣợc trồng cách đây 5000 năm. Các phân tích hóa
sinh cho thấy rằng hạt đậu tƣơng chứa từ 38-40% protein. Hơn nữa đậu tƣơng
còn chứa đầy đủ và cân đối những axit amin cần thiết (trong đó có những axit
amin không thay thế nhƣ lyzin, tryptophan) và nhiều loại vitamin B1, B2, A,
C, D, E, K. Trong đậu tƣơng cũng chứa 12-25% lipit, 10-15% gluxit, các
muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các enzym, sáp, nhựa, có giá trị dinh
dƣỡng cao, có tác dụng tốt với sức khỏe con ngƣời.
Đậu tƣơng là loài cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, khó có thể
tìm thấy loại cây nào có tác dụng nhiều mặt nhƣ cây đậu tƣơng. Sản phẩm của
nó làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho các ngành
sản xuất công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm. Hạt đậu tƣơng là sự kết
hợp độc đáo các đặc tính làm cho chúng trở thành loại thực phẩm đa năng
nhất trong các loại thực phẩm. Sản phẩm hạt đậu tƣơng đƣợc sử dụng trực
tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế biến các sản phẩm khác nhƣ: sữa đậu nành,
bánh kẹo, đậu phụ. Ngoài ra đậu tƣơng còn đƣợc dùng trong sản xuất dƣợc
liệu với nhiều vị thuốc có giá trị ở nƣớc ta.
Cùng với sự ấm dần lên của Trái Đất, cây trồng cũng phải thích nghi với
điều kiện môi trƣờng. Cây trồng có sức chống chịu tốt mới có thể tồn tại và
nâng cao năng suất. Để nâng cao năng suất của cây đậu tƣơng một trong các
biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với điều kiện ngoại
cảnh bằng cách cải tiến kĩ thuật, chọn giống mới hoặc lựa chọn những nơi có

Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng khác nhau
với nồng độ muối, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với nồng độ
muối. Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của
thực vật nói chung và của đậu tƣơng nói riêng. Những biến đổi của giai đoạn
này sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây về sau. Xuất phát
từ các nội dung nêu trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Sự biến động hoạt độ
catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây m ặn và pha
phục hồi sau nhiễm mặn”.
2


2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza và peroxidaza ở mầm đậu
tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Động thái hoạt độ enzym catalaza, peroxidaza trong 2 pha sinh trƣởng
của đậu tƣơng (pha gây mặn và pha phục hồi ).
- Xác định một số chỉ tiêu sinh trƣởng nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài mầm
ở pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT84
Phạm vi nghiên cứu: giai đoạn nảy mầm của đậu tƣơng.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Bổ sung nguồn tƣ liệu về ảnh hƣởng của muối tới quá trình nảy mầm
đậu tƣơng và vai trò của enzym chống oxy hóa trong quá trình này.
- Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các thông tin, các dữ
liệu khoa học làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa
học.

3


mầm, đó là: pha trƣơng hạt, pha hình thành và hoạt hóa enzim, pha tích lũy
chất dinh dƣỡng, pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ
đặc biệt cho cơ thể.
Sự nảy mầm của đậu tƣơng cũng bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc nhờ cơ
chế hút nƣớc của hạt làm hạt trƣơng lên, rễ mọc ra, thân vƣơn lên đội hai lá
mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân
chính.
Trong giai đoạn này, cây non sống chủ yếu vào nguồn chất dinh dƣỡng
dự trữ ở trong hai lá mầm, đến khi hết chất dinh dƣỡng các lá mầm này
chuyển sang màu vàng rồi rụng và đồng thời cũng là lúc mà bộ rễ phát triển
đủ để có khả năng hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng từ trong đất lên để nuôi
cây.
Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nếu gieo
vào vụ hè, giai đoạn này ngắn hơn vụ đông. Thông thƣờng thời gian này
khoảng 15-20 ngày sau khi gieo. Thời kì này sẽ quyết định mật độ cây non
cũng nhƣ sức sinh trƣởng của cây đậu tƣơng sau này.
1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật.
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl, điều đó
đã hạn chế khả năng hút nƣớc và chất dinh dƣỡng của cây. Đất bị nhiễm mặn
sẽ gây nên hai tác hại đối với thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng.
Tác hại thứ nhất, mặn gây ra hiện tƣợng hạn sinh lý. Đất nhiễm mặn
chứa hàm lƣợng muối cao nên áp suất thẩm thấu môi trƣờng lớn. Nếu áp suất
thẩm thấu nội bào không thắng nổi áp suất môi trƣờng thì cây sẽ bị khô héo
do nƣớc từ trong tế bào ra ngoài. Thiếu nƣớc nhẹ làm giảm tốc độ sinh
trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh
làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nƣớc nguyên sinh chất bị
đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và chết.

5

6


hữu cơ để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của chính mình. Các chất tích lũy
chủ yếu là các axit hữu cơ, axit amin, các đƣờng. Ngoài ra, các hợp chất
proline, betaine, putressin cũng đƣợc hình thành khi bị mặn.
1.3. Vai trò của catalaza và peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật.
1.3.1. Vai trò của enzym catalaza
Catalaza là enzym chủ yếu loại bỏ H2O2 đƣợc tạo ra nhiều trong
peroxisom bởi quá trình quang hô hấp. Hoạt động của enzym này giảm xuống
khi bị ức chế, chẳng hạn khi nồng độ CO 2 cao.
Catalaza thực vật đƣợc mã hóa bởi một họ gen nhỏ, thƣờng gồm 3 gen
isozym, có mô hình biểu hiện rất khác nhau về không gian cũng nhƣ thời gian
trong suốt đời sống của thực vật. Khi thực vật bị stress nƣớc, ở mức độ nội
bào sẽ tạo ra oxi gây hại chẳng hạn nhƣ gốc supeoxit (O 2.-), H2O2 và gốc .OH
tự do, đây là nguyên nhân gây hƣ hại cho màng sinh chất. Và một trong
những cơ chế giải độc của thực vật đó là hệ thống enzym chống oxi hóa:
superoxit dismustaza chuyển gốc supeoxit thành O 2 và H2O2, sau đó H2O2
đƣợc giải độc nhờ enzym catalaza và ascorbat peroxidaza.
CAT đƣợc tìm thấy trong peroxisome, bào tƣơng và ty thể, kết hợp hoạt
động của catalaza và superoxide dismutaza là rất quan trọng trong giảm nhẹ
tác động của stress oxy hóa.
1.3.2. Vai trò của enzym peroxidaza
Peroxidaza có rất nhiều dạng trong thực vật. Khi cây bị stress thì hoạt độ
peroxidaza tăng lên. Peroxidaza đƣợc coi nhƣ một thông số sàng lọc với các
stress sinh lý khác nhau. Hoạt động của enzym này tăng khi cây bị cảm ứng
với lạnh, hạn, muối và thiếu oxi. Hoạt động của enzym này cũng đƣợc dùng
nhƣ là chỉ thị cho các kiểu ô nhiễm khác nhau.

7

8


năng về khả năng thích ứng của cây trong điều kiện stress mặn[29]; ( Glycine
max L.), những thay đổi trong các enzym chống oxy hóa và khả năng chống
chịu stress mặn và kẽm ứng dụng trong đậu tƣơng; Çelik và cs, nghiên cứu về
ảnh hƣởng của từ trƣờng đến hoạt độ của superoxide dismutaza và catalaza
trong Glycine max (L.) Merr [23] …
Nhiều nghiên cứu đã gợi ý rằng SOD, POD, và CAT tăng lên đáng kể ở
một số thực vật khi chịu mặn (Gao et al.,2008[25]; Azooz et al., 2009[17] ).
Những phát hiện này gợi ý rằng một hệ thống enzym chống oxy hóa hiệu quả
trong các loài thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiệt hại
oxy hóa do căng thẳng muối.
Báo cáo trƣớc đó cho rằng cây bảo vệ khỏi bị hƣ hại oxy hóa do muối
căng thẳng bằng cách tăng SOD, POD và CAT ở Jatropha curcas, ngô và các
loài thực vật khác (Parvaiz và Satyawati, 2008[28]; Gao et al, 2008. Azooz et
al., 2009)[31]. Những kết quả này gợi ý rằng stress muối có thể dẫn đến thay
đổi đáng kể trong SOD, POD và CAT các hoạt động tham gia vào quá trình
loại bỏ ROS[31].
1.4.2. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu về đậu tƣơng trong những năm qua chủ yếu đi sâu về
phƣơng diện hình thái, di truyền, chọn giống, sinh học phân tử, một số nghiên
cứu về sinh lý học, khả năng cộng sinh cố định đạm của một số dòng vi khuẩn
ở đậu tƣơng. Những năm gần đây nhờ sự trợ giúp của các thiết bị hiện đại,
nhiều nghiên cứu sâu hơn về tính chịu mặn đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu
tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam đƣợc tiến hành sâu rộng ở các đối
tƣợng lúa, đậu tƣơng, lạc, thuốc lá, nhãn…trong đó đậu tƣơng là cây trồng
đƣợc chú trọng khá nhiều. Chẳng hạn nhƣ nghiên cứu đặc điểm di truyền và
khả năng chịu hạn ở đậu tƣơng ( Nguyễn Huy Hoàng) [5], nghiên cứu mối
quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần điện di của protein đậu tƣơng (Trần



CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Giống đậu tƣơng DT 84, là giống đậu tƣơng đƣợc chọn tạo bằng phƣơng
pháp xử lý đột biến dòng 8-33 (DT80 x ĐH4) bằng tia Gamacol 18Kr, áp
dụng chọn lọc 3 hoặc 1 hạt đến M8 thì chọn đƣợc DT 84 ổn định. Đây là
giống ngắn ngày, thích ứng rộng có nhiều tiềm năng.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa
học và Chuyển giao công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành gieo hạt trong dung dịch
muối theo phƣơng pháp của Volcova có cải tiến.
Chọn hạt giống đều, chắc, không bị sâu bệnh. Khử trùng khay bình,
dụng cụ… bằng cồn. Giâý lọc đƣợc sấy ở 1300 trong vòng 1 giờ, hạt đƣợc
khử trùng bằng dung dịch KMnO 4 5% trong 5 phút.
Dung dịch NaCl chọn 3 nồng độ để đạt tỷ lệ nảy mầm 60-70%
Khay cho hạt nảy mầm, giấy thấm, nƣớc cất…
Hạt giống có khả năng nảy mầm cao.
Cách tiến hành:
Chọn hạt khỏe cho vào túi vải màn rồi xử lý bằng dung dịch KMnO 4 5%
trong 5 phút làm khô nhẹ rồi đặt vào khay. Trƣớc đó khay đƣợc khử trùng
bằng cách sấy khô 1050 trong vòng 1 giờ cùng với giấy thấm.
Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:
Phần 1: Lô đối chứng cho hạt nảy mầm trong nƣớc cất.
Phần 2: Lô thí nghiệm cho hạt nảy mầm trong dung dịch muối với các
nồng độ 0,4; 0,6; 0,8 (%) và đặt tên tƣơng ứng là các mẫu thí nghiệm M0,4;
M0,6; M0,8. Chúng tôi tiến hành chọn 3 nồng độ muối này để nghiên cứu là

b: Số hạt nảy mầm trong lô đối chứng

12


2.2.2.2. Xác định chỉ tiêu sinh trƣởng của mầm
Chiều dài mầm (mm): Sử dụng thƣớc đo chia đơn vị đến mm để đo chiều
dài mầm vào 2 ngày cuối của pha gây mặn và pha phục hồi.
2.2.2.3. Xác định hoạt độ emzym catalaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ
(theo Nguyễn Quang Vinh và cộng sự)[11].
* Nguyên tắc thí nghiệm:
Catalaza xúc tác cho phản ứng:
Catalaza
2H2O2

O2 + 2H2O

Để định lƣợng catalaza có thể dùng KMnO 4 0,1N để xác định lƣợng H2O2
trƣớc và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lƣợng H2O2 bị chuyển hóa.
5H2O2 + 2KMnO4

3H2SO4, 8H2O

2MnSO4 + K2SO4 + 5O2

* Cách tiến hành:
a, Pha hóa chất
-Đệm photphat 50mM (pH7,0); (a) hòa tan 6,81g KH2PHO4 trong
1000ml nƣớc cất; (b) hòa tan 11,41g K2HPO4.3H2O trong 1000ml nƣớc cất;
trộn dung dịch a với b cho đến khi đạt pH 7,0.

a: khối lƣợng (g) mẫu (200mg = 0,2g)
Số đơn vị catalaza trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút):
C(U/mg) =
Trong đó, 30: thời gian enzym tác dụng; 0,034:1 µmol đƣơng lƣợng H2O2
2.2.2.4. Xác định hoạt độ enzym peroxidaza bằng phƣơng pháp so màu
dùng pyrogallol làm cơ chất[20].
* Hóa chất.
-NaOH, H2O2, KH2PO4, pyrogallol.

14


* Pha hóa chất.
-NaOH 2M: Cân 8g NaOH pha với 90ml nƣớc sau đó dâng nƣớc đến
vạch 100ml (bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tháng).
-Đệm photphat (pH=6) 0,1M: Hòa 6,8g KH2PO4 vào 450ml nƣớc cất,
sau đó thêm NaOH 2M để đạt pH=6 rồi dâng nƣớc đến vạch 500ml.
-H2O2: Pha 0,66ml H2O2 30% với 5ml nƣớc cất (chuẩn bị mới mỗi
ngày, cho vào bình tối).
-Pyrogallol 5,33%: Hòa 1,333g pyrogallol trong 20ml nƣớc cất, sau đó
dâng lên vạch 25ml (bảo quản lạnh trong lọ tối và pha mới mỗi ngày).
* Cách tiến hành
Nghiền mẫu với đệm pH 6 theo tỷ lệ 1 phần mẫu:5 phần đệm. Ly tâm
dịch nghiền 10000 vòng ở 00C trong 15 phút.
Tách lấy dịch chiết đo quang phổ ở bƣớc sóng 420nm.
Thành phần các chất ở blank và ống thí nghiệm.
Blank

TN


Đo kinetis ở bƣớc sóng 420nm trong khoảng 3 phút, 20s nghi lại 1 lần để
tính toán.
* Tính hoạt độ enzym
U/ml=X =ΔE420/20s x 2,5 x df
U/mg = X/mg mẫu.

15

5
df=
= 50
0,1


2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu.
Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel 2003 theo các tham số : giá trị trung bình ( ), sai số trung bình (m), sai
số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm (m%), độ
tin cậy của hai số trung bình (td) đƣợc tính theo các công thức sau :

=

m% =

md =

m=

td =