Bễ Y Tẫ
TRĩễNG DAI HOC DĩC H NễI

NGUYEN THE NAM

SO Bễ NGHIấN CĩXJ THNH PHAN HO HOC
V TC DUNG
CHễNG DIĩNG
CĩA L


CHẩ XANH NHT BN
Hydrangea macrophylla Seringe var. thunbergii Makino Saxifragaceae

(Khụa luõn tụt nghiờp dutic sù dai hoc khoõ 1998-2003 )

Giõo viờn hirong dõn Th.S Lờ Viờt Dỷng
Th.S Nguyờn Thộ Hựng
Noi thtfc hiờn
Viờn Diroc liờu- Khoa hụa thuc võt
Bụ mon Du'ỹc hoc co truyờn.
Thụi gian thuc hiờn
Thõng 3 dởn thõng 5/2003

cy

.
LễI CM ON
Dờ cụ diùỗfc nhỹng kờ t qua trong khụa luõn ny tụi dõ
nhõn diùỗfc sttg iu p dd tan tinh cỷa thõy hiùụng dõn. Tụi xin
g iti ld i cm cfn chõn thnh vụi long biờ't dn sõu sac tụi:
Th. S Nguyờn The Hựng
Th. S Lờ Viờt Dỹng- Viờn Duofc lieu
Th. S Nguyờn Thi Xuõn Hoa- Viờn duofc lieu
Tụi cỹng chõn thnh cõm dn TS. Pham Van Thanh v cõc
cụ chu Khoa Hoõ thitc võt dõ tao m oi diờu kiờn thuõn ld i cho
0

0

0



0

0

0

tụi hon thnh khụa luõn tụ'tnghiờp.
Tụi xin by to long biờ't dn sõu sõc tụi cõc thõy cụ giõo
trong tritdng, dac biờt l cõc thõy cụ Bụ mụn Dtfdc cS truyốn
cựng cõc ban bố dõ tao diờu kiờn thuõn ld i v dụng viờn tụi
trong suụ't thdi gian thtfchiờn dờ ti tụt nghiờp.
H N ỗ i n g y20/5/2003



N G U Y Ê N V Â T L IE U V À P H I/O N G P H Â P
N G H IÊ N CÜXJ

2.1 Nguôn nguyên lieu, thu hâi và chê bien................................ 10
2.1.1 Nguôn nguyên lieu..................................................................... 10
2.1.2 Thu hâi và ché bien.....................................................................10
2.2 Phirong tien hôa chat dùng trong nghiên cüru.........................10
2.2.1 Dông vât thi nghiêm................................................................... 10
2.2.2 Thiét bi mây môc sir dung..........................................................10
2.2.3 Hôa châ't dùng trong nghiên curu................................................10
2.3 Phiïcmg phâp nghiên cufu............................................................11
2.3.1 Nghiên ciîu thành phân hôa hoc.................................................11
2.3.2 Nghiên ciru vê tac dung duoc iÿ.................................................12
PH A N 3

T H U C N G H IÊ M V À K Ê T Q U À

3.1 Nghiên ciru thành phân hôa hoc............................................. 13
3.1.1 Dinh trnh câc nhôm chât hôa hoc trong la CXNB..................... 13
3.1.2 Dinh tmh bàng SKLM câc nhôm châtchînh trong la CXNB .20
3.1.3 Dinh luong câc nhôm chât chînh trong la CXNB.....................25
3.2 Thu tac dung sinh hoc.................................................................. 31


3.2.1 Chuân bi nguyên liêu.................................................................. 31
3.2.2 Tien hành..................................................................................... 32
3.2.3 Tmh két quâ.................................................................................35

PHAN 4

Chè xanh Nhât Bân là loai cây dâ duoc nghiên cûu sû dung vôi mue
dich làm thuôc chô'ng di üng và cô mât trong duoc diën Nhât [24], [14]. Hiên
nay cây duoc di thuc trong tai Sapa theo don dât hàng cüa Nhât Bân. Nên vân
dé nghiên cûu thành phân hôa hoc cüng nhu tâc dung sinh hoc cûa cây
CXNB sinh truông tai Sapa (Viêt Nam) là rat cân thiêt dë chuàn hoâ nguôn
nguyên lieu. Khoâ luân tôt nghiêp này gôp phân nghiên cûu cây CXNB vôi
câc mue tiêu sau:
1 Sa bo nghiên cûu thành phân hôa hoc trong la cây
2 Thü tâc dung chông di ûng cüa mot sô dich chiét tù la
1


PHAN1

TễNG QUAN

1.1 DC DIấM THĩC VT V PHN Bễ


1.1.1





Vi tri phõn loai cõy CXNB
Cõy chố xanh Nhõt Bõn cụ tờn khoa hoc l Hydrangea macrophylla

Seringe var. thunbergii Makino ho Thuụng Son [7] hay cụn goi l Ho Cụ tai
h6 [4] (Saxifragaceae ), bụ Cụ tai ho (Saxifragales ), lien bụ Hoa hụng

loi phõn bụ Chõu A, An Dụ v phia bac nuục M, trong dụ Chõu A cụ hon
20 loi [25], [11].
1.1.4 Dõc diởm thuc võt v phõn bụ cõy CXNB

nh 1

Cõy chố xanh Nhõt Bõn

Cõy chố xanh Nhõt Bõn Hydrangea macrophylla Seringe var. thunbergii
Makino Saxifragaceae thuục dang cõy bui, thõn nhõn vụi nhỷng cnh chõc
khoố. La phia trờn tron, hợnh mỷi giõo hoõc hợnh elip, di 5-15cm, rụng 210cm, cụ rõng cua. La cụ mu xanh lue dởn xanh sang, phõn trờn la cụ ft
lụng bõo vờ gn gõn la, mõt duụi nhiờu lụng. Cum hoa hợnh xim hay hmh
chu dợnh, cụ lụng bõo vờ. Hoa vụ tfnh ngoi, cõnh di cỹa hoa vụ trnh
hợnh trụn. Hoa luụng trnh trong, vụi di hoa nhụ. Trng hoa nhụ, hợnh
trumg. Hat phõn hợnh cõu. Quõ nang, hợnh trirng di 3-4mm ụm cõ vụi nhuy.
Cõy phõt triởn tu nhiờn nui Honshu (Hn Quụ'c) v Nhõt Bõn [11].
3


1.2 NHÜNG KÉT QUÂ NGHIÊN CÛU VÊ CÂY CXNB
1.2.1 Thành phàn hôa hoc
Hiên nay trong niroc chua co két quâ nghiên cûu nào vê thành phàn hôa
hoc cüa CXNB duoc công bô. Théo câc tài lieu nuôc ngoài, trong lâ cây cô
chüa câc nhôm chât chînh sau [14-22]:
•

Isocoumarin: hydrangenol, hydrangenosid (A, E, G), macrophyllosid,

thunberginol (A, B, C, D, E, F, G, î), phyllodulcin, hydramacroside (A, B),
hydramacrophyllol (A, B).

-OH

-H

-H

Thunberginol A

-H

-OH

-OH

-H

Thunberginol B

-H

-OH

-OH

-OH

Thunberginol C dehydroxyl

-H


-OH

-OH

-H

-H

Thunberginol I

dehydroxyl

-OCH3

-OH

-H

-H

Phyllodulcin

dehydroxyl

-OH

-OCH3

-H


Dich chiêt methanol tù lâ cô tâc dung chông di üng, chông loét và cô tâc
dung loi mât. Tù dich chiêt Metanol nguoi ta dâ tâch duoc câc thành phàn
không phân eue (gôm Hydragenol, Phylloducin) cô tâc dung chông di üng,
chông loét và loi mât [15].
Thunberginol A, B, F cô tâc dung chông di üng và thành phân này thë
hiên tâc dung chông di üng manh hon tâc dung cûa câc chât Hydragenol,
Phylloducin [20].
Thunberginol C, D, E, G và Hydragenol 4 -O-glucosid cô tâc dung chông
di üng trên chuôt, xâc dinh bàng phân üng Schultz-Dale. Thành phàn này côn
cô tâc dung ûc ché su giâi .phông Histamin tù té bâo Mast cûa khi quân chuôt
lang [17],
Bàng phân üng khâng nguyên- khâng thë nguôi ta dâ xâc dinh mot thành
phàn Hydramacrosides A, B trong lâ cô tâc dung ûc ché giâi phông Histamin
trong dich màng bung tù té' bâo màng bung chuôt [21],
Thành phàn Hydramacrophyllol A và B trong lâ CXNB cüng cô tâc dung
chông di üng trên chuôt, duoc xâc dinh bàng phân üng KN-KT [18].
• Tâc dung khâc:
Ngoài nhüng tâc dung dâ duoc nghiên cûu trên. Trung Quôc và Nhât Bân
con sû dung lâ cüa chè xanh Nhât Bân theo kinh nghiêm dân gian làm thuôc
chông nam [12].

6


1.3 DAI Cl/CNG Vấ D Iĩ N G [1], [5], [8], [9]
1.3.1 Khõi niờm
Di ỷng l tùnh trang phõn ỷng quõ mire cỹa co thộ dụi vụi nhỷng kfch thfch
dõc hiờu v khụng dõc hiờu khi nhỷng tac nhõn gõy kfch thfch xõm nhõp vo
co thộ lõn thỹr hai.
1.3.2 Nguyờn nhõn gõy di ỹng

- Thay d6i nhiêt dô, dô âm (Nông, lanh, dô âm thay d6i...)
- Do vi khuân, vi rut và câc dôc tô cüa chüng gây ra.
- Do câc yêu tô lÿ hoa (tiép xüc vôi tia UV, môi truông acid, base...)
Di nguyên nôi sinh duoc chia thành di nguyên nôi sinh tu nhiên và di
nguyên nôi sinh thü phât:
- Di nguyên nôi sinh tu nhiên là câc té bào cûa co thé nhung ît duoc tiép
xüc vôi hê mâu và câc té bào cô thâm quyên miên dich.
- Di nguyên nôi sinh thü phât là hâu quâ cüa yêu tô nhiêm trùng hoâc lÿ
hoa tâc dông.
1.3.3 Co ché và phân loai
Khi khâng nguyên làn dau tiên xâm nhâp vào co thé, câc té bào cô thâm
quyên miên dich thuc hiên câc chüc nâng cüa chüng:
- Lympho T nhân diên khâng nguyên nhô câc thu thé dâc hiêu trên bê
mat.
- Lympho B két hop vôi khâng nguyên và chuyén sang dang plasmocyte,
sân xuât câc khâng thé dâc hiêu( IgA, IgM, IgE, IgG và IgD ). Câc
khâng thé này gân lên bê mât té bào và tôn tai trong co thé.
- Khi cô su xâm nhâp cüa cùng mot khâng nguyên vào co thé làn thü
hai. Câc khâng thé dâc hiêu duoc sân xuâ't manh và két hop vôi khâng
nguyên gây tàng nông dô câc chât trung gian hoa hoc gây ra phân üng
di üng
Dira trên vai trô cüa khâng nguyên, khâng thé dâc hiêu và tinh trang
bênh lÿ mà Gell và Coobs dâ phân di üng ra 4 typ sau:
8


T yp l
- L loai di ung quõ mõn tire thi hay quõ mõn phõn vờ. Cõc biộu hiờn di
ung diờn ra nhanh.
- Do cõc khõng thở IgE co kh nõng cụ dinh trờn cõc Mastocyte tộ chỷc


2.1 NGUễN NGUYấN LIEU, THU HI V CHấ BIEN
1.1.1 Nguụn nguyờn lieu:
Nguụn nguyờn lieu lõy tai trung tõm cõy thuục Sapa truc thuục Viờn
Duac lieu
1.1.2 Thu hai v chở bien:
La cõy duac thu hai vo thõng 11/2002, dộ khụ trong diờu kiờn tu nhiờn.
Sau khi dem vờ viờn duac lieu duac sõy lai v bõo quõn trong diờu kiờn thich
hỗfp. Khi dựng dem sõy lai 40C trong 1 tiởng.
2.2 PHI/ONG TIEN HOA CHAT DNG TRONG NGHIấN CĩU
2.2.1 Dụng võt thi nghiờm
Chuụt cụng trõng khụng phõn biờt duc, cõi cụ trong luang tự 100-110g,
nuụi trong cựng diờu kiờn thf nghiờm.
2.2.2 Thiởt bi mõy moc su dung
- Mõy do dụ õm Prộcisa HA60
- Mõy cõt thu hụi dung mụi cỹa hõng BUCHI
- Mõy quang kờ
- Mõy phõt quang
- Bờp cõch thỹy
2.2.3 Hoa chat dựng trong nghiờn curu
- Hoõ chat sỹ dung dat tiờu chuõn phõn tich: chloroform, ether, acid
sulfuric, acid chlohydric, natrihydroxyd, methanol, cụn v mot sụ hoa
chat thuục thỹ khõc.
- Bụt trõng sc k v bõn mụng trõng sõn cỹa hõng Merck.

10


2.3 PHITONG PHÂP NGHIÊN CÛU
2.3.1 Nghiên cthi thành phân hoa hoc


+ Nguyên tâc: flavonoid duoc chiêt bàng côn cao dô. Dich chiêt loai
dung môi dén càn và hoà tan lai flavonoid trong nuôc dé loai tap. Dich nuôc
lai duoc loai tap bàng dung môi hüu co cô dô phân eue thâ'p. Cô dich thu
duoc càn flavonoid.
+ Tmh két quâ: tuong tu theo công thuc trên.
- Dinh luong coumarin trong lâ duoc liêu bàng phuong phâp cân.
+ Nguyên tâc: Chiét coumarin trong lâ chè bàng côn cao dô. Loai tap
trong dich chiêt thu duoc nho phàn ung mô dong vông Lacton trong câc môi
truông khâc nhau.
+ Tmh két quâ: Công thuc tmh tuong tu nhu tfnh hàm luong alcaloid.
2.3.2 Nghiên ciru vè tâc dung dtftfc lÿ
- Nghiên cüu tâc dung chông di üng theo phuong phâp Kark(l) dâ duoc
chînh lÿ tai khoa Duoc lÿ sinh hôa -Viên Duoc lieu [13].
- Nguyên tâc: Tao khâng thë khâng long trâng trung cho co thë chuôt.
Dua khâng nguyên long trâng trüng vào chuôt lân hai và dùng thuôc (duoc
lieu) du dinh thu tâc dung chông di üng. Tâc dung cüa thuôc duoc dânh giâ
thông qua su thoât mach chât màu xanh trypan do phân üng di üng gây ra. So
sânh su thoât mach chât màu xanh trypan giüa câc mâu thü, chuân vôi mâu
doi chüng: Mâu nào kim hâm su thoât mach tôt hon mâu dôi chüng(tüc nông
dô xanh trypan thâp tai vùng gây di üng, duoc thë hiên thông qua dô hâp thu
chât màu à buôc sông 630nm) thi mâu dô cô tâc dung chông di üng.
- Xü lÿ két quâ theo phuong phâp thông kê T-students.

12


PHÂN 3

THl/C NGHIÊM YÀ KET QUÂ

dung dich FeCl3 5%
Kët quâ: Cô tüa và dung dich chuyën màu xanh den (phân üng duang tinh)
- Phân irng vdi kiêm:
+ Lây 2ml dich chiët vào ong nghiêm, thêm vài giot dung dich NaOH
10% vào, thây cô tüa duc và màu vàng tâng lên (phân üng duang tmh)

13


+ Nhô 2 giot dich chiét lên môt mânh giây loc, dë khô nhô chông lên
vài giot NaOH 10% thây màu vàng dâm lên rât rô (phân üng duong tmh)
Két luân: Sff bô két luân trong lâ CXNB cô flavonoid.
3.1.1.3

Dinh tinh coumarin

Lâ'y 10g duoc lieu vào bïnh càu 250ml, thêm 50ml côn 90°dun câch thuÿ
soi 5-10 phüt. Dé nguôi ,loc, dich loc dem làm câc phân üng:
- Phân irng mtf dông vông lacton: Cho vào hai ong nghiêm nhô môi ong
2ml dich chiét.
Ong 1: Thêm 1ml NaOH 10%
a/

7

Ong 2: Dê nguyên
Dun câ hai ong dén soi, quan sât thây ong 1 cô tüa duc vàng, ông 2 trong
nhu ban dâu. Thêm vào câ hai ông nghiêm môi ông 2ml nuôc cât. Lâc dêu,
quan sât thây
Ông 1: trong trô lai

Dinh tinh tanin

Ly 5g duoc lieu cho vo cụ'c cụ mụ, thờm 30ml nuục ct, dun cõch thỷy dở
soi 5-10 phỷt, dở nguụi, loc qua giõy loc. Dich loc dem lm cõc phn ỷng
dinh tmh sau.
- Phõn urng vụi gelatin 1 % : 2ml dich chiờt vo ong nghiờm nhụ, nhụ 2-3
giot dung dich Gelatin 1%. Xuõt hiờn tỹa bụng trõng rụ.
- Phõn ung vụi dung dich FeCl3 5%:

Cho 2ml dich chiột vo ụng

nghiờm, thờm 1ml thuục thỷ FeCl3 5%. xuõt hiờn tỹa nõu den.
- Phõn ỷng vụi dung dich dong (II) acetat: Cho 2ml dich chiờt vo ụng
nghiờm, thờm 1ml thuục thỷ dong (II) acetat. Tỹa trõng xanh.
- Phõn ỷng vụi dung dich chù acetat: Lõy 1ml dich chiột trờn vo ụng
nghiờm nhụ, thờm 2-3 giot thuục thỹ Pb(CH3COO)2. Cụ tỹa trõng duc.
Kột luõn: Trong lõ CXNB cụ chỷa tanin.
3.1.1.5

Dinh tinh anthranoid (dang ton phn)

Lõy 5g duoc lieu cho vo cục cụ mụ, thờm 15ml nuục, dun cõch thỷy soi
5 phỹt. Loc, dich loc thu duoc acid hoõ bng H2S04 10% rụi chuyởn vo
binh gan. Chiột anthranoid bng 5ml ether, gan vo ụng nghiờm nhụ. Cụ dich

15


cèn khoâng lml. Nhô doc theo thành ong nghiêm 1ml NaOH 10%. Lôp
kiêm không cô màu dô sim (phân ûng âm tmh).

- Phân ûng Légal: Hoà tan cân trong ông nghiêm côn lai bàng lml côn
16


90°, thêm 1-2 giot Natrinitroprusiat 0.5% sau do thêm 2 giot NaOH 10%.
Phân üng không xuât hiên màu dô (phân üng âm tmh)
Két luân: Sa bô két luân trong lâ CXNB không chûa Glycosid tim.
3.1.1.8

Dinh tmh sterol

Lây 10g duoc lieu cho vào binh non co nüt mài, thêm 50ml nuâc cât,
ngâm qua dêm, loc qua giây loc. Dich loc thu duoc loai tap chât bàng chî
acetat du, loc. Loai chî acetat du bàng dung dich Na2C 03 10%, loc. Dich loc
cho vào bînh gan. Thêm 10ml acid sulfuric 10%, dun câch thüy dë thûy phân
trong 10 phüt. Chiét phytosterol bàng 15ml chloroform (chia 3 lân theo tî lê
5:5:5), gom dich chiét lai roi chia vào hai ông nghiêm nhô dem làm câc
phân üng dinh tmh sau:
- Phân ufng Liberman: Làm bay hoi ông nghiêm thur nhât dén khi côn
cân. Hoà tan hét cân bàng 1ml anhydrid acetic, dât nghiêng ông nghiêm 45
dô và cho tir tir theo thành ông 1ml acid sulfuric dâc sao cho phân thành hai
lôp, lôp acid à duôi.
Két quâ: Phân tiép xüc giua hai lôp không xuât hiên vông tim dô.
(phân üng âm tmh)
- Phân üng Salkopski: Làm bay hoi dung môi trong ông thur hai dén khi
côn khoâng 1ml. Dât nghiêng ông nghiêm 45 dô và nhô theo thành ông 1ml
acid sulfuric dâc sao cho chüng tâch thành hai lôp, lôp acid à trên.
Két quâ: Lôp tiép xüc giüa hai lôp không xuât hiên vông tim dô
(phân üng âm tmh)
Két luân:

soi 2 phüt, loc qua giây loc. Lây 2ml dich loc thêm vài hat Na2C 03. Trong
ông nghiêm không cô bot khi bay lên (phân üng âm tmh)
Két luân: trong lâ CXNB không cô acid hüu cor.
3.1.1.12 Dinh tinh uronic
Lây 2g duoc lieu vào ông nghiêm to thêm 10ml acid sulfuric 10%, dun
sôi câch thüy trong 5 phüt, loc vào ông nghiêm nhô, bôc hoi dê'n khô roi
thêm 5ml côn 90°, lâc nhe. Không thây cô két tüa tao thành (phân üng âm
tmh)
Két luân Sa bô két luân trong lâ CXNB không cô uronic.
18


Nhir vây, bàng câc phân ümg dinh tmh trong ông nghiêm, so bô
ket luân trong la CXNB cô câc nhôm chat alcaloid, flavonoid,
tanin, coumarin, duông klnï và carotenoid.
Bâng 1 Ket quâ dinh tmh so bô câc nhôm chat trong lâ
TT

Nhôm chat

1

Alcaloid

2

Flavonoid

3


Phân ûng Diazo
++
Mô dông vông Lacton
+++
Vi thâng hoa
+++
Chi acetat
+++
Dung dich Gelatin
+++
Dung dich FeCl35%
Tao bot
Phân ûng Bomstraeger
Phân üng Libermann
Phân ûng Salkopski
Phân ûng Baljet
Phân üng Légal
Vét bông mô trên giây
++
h 2so 4
+++
Thuôc thü Felling
Na2C 03
-

-

-

Ket luân

10
11
12

-

-

Chu thfch:
+

: Co phân üng.

++

: Phân ûng duong tmh rô.

+++ : Phân ûng rât rô.
19

Không cô
Cô caroten
Cô
Không cô


3.1.2 Dinh tmh bàng SKLM câc nhôm chât chînh trong lâ CXNB
3.1.2.1

Nhôm alcaloid