BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
NGUYỄN THỊ LIÊN

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN
MSSV: 3103971
LỚP : VSVH K36

Cần Thơ, tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM SP.
GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:


năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Kí tên)


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn không chỉ có sự nổ lực và cố gắng của bản thân mà còn
có sự động viên và giúp đở rất nhiệt tình và chân thành của quý thầy cô, gia đình, bạn
bè. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến:
Quý thầy cô Giảng viên viện NC và PT Công nghệ Sinh học của trường Đại học
Cần Thơ đã truyền dạy cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong quá trình
học tập và nghiên cứu tại viện.
Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập cô Nguyễn Thị Pha, thầy Võ Văn Song Toàn và
tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã động viên, chia sẽ và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt
quá trình học vừ qua. Đồng thời tôi xin cảm ơn các thầy cô phụ trách các phòng thí
nghiệm của Viện đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng trang thiết bị để hoàn thành luận
văn.
Thành kính cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi trong suốt tiến trình làm thí nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân chân thành đến những người thân trong gia đình
đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập.
Xin chân thành cảm ơn tất cả!

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013

Nguyễn Thị Thảo Nguyên



TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. vi
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .....................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................... 2
2.1. Giới thiệu về cây ớt ......................................................................................2
2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt ...........................................................................3
2.2.1. Tác nhân gây bệnh...........................................................................4
2.2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh thán thư ...................................5
2.2.3. Triệu chứng bệnh.............................................................................5
2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm ...........................................................................6
2.2.5. Tình hình nhiễm bệnh .....................................................................8
2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp. .......................................................9
2.3.1. Phân loại ..........................................................................................9
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................10
2.3.3. Đặc điểm chung. ............................................................................12
2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm ...........................................13
ii


CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 15
3.1. Thời gian.....................................................................................................15
3.2. Địa điểm......................................................................................................15
3.3. Phƣơng tiện ................................................................................................15
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ..........................................................15
3.3.2. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................16
3.3.3. Hóa chất .........................................................................................16
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................16
3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu ...................................................................16
3.4.2. Phân lập nấm bệnh ........................................................................17

Trang
Hình 1: Một số loại ớt ..................................................................................................... 3
Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thư trên trái ớt. ................................................................... 4
Hình 3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp. ................................................ 7
Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện thường xuyên và nghiêm trọng. ......8
Hình 5. Bào tử một số loài Colletotrichum sp............................................................... 13
Hình 6. Sơ đồ quy trình phân lập nấm .......................................................................... 17
Hình 7. Khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. 26
Hình 8. Các dạng bào tử nấm Colletotrichum sp. ở độ phóng đại 1000 lần ................. 31

v


TỪ VIẾT TẮT

bp

Base pair, cặp bazo

BSA

Bovine Serum Albumin

DNA

Deoxyribo nucleic acid

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long


Polymerase Chain Reaction

pH

hydrogen power

rpm

round per minute

TBE

Tris – Boric acid - EDTA

TE

Tris EDTA

UV

Ultra Violet

V

Voltaire

vi



1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập các dòng nấm Collectotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây ớt.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây ớt
Cây ớt (Capsicum ssp.) thuộc chi Capsicum của họ cà (Solanaceae) gồm 5 loài
thuần hóa (C. annuum, C. baccatum, C. Chinense, C. frutescens, C. pubescens) với
hơn 20 loài hoang dại. Là loài cây chịu nhiệt, nhiệt độ thích hợp tăng trưởng là 18 –
280C khi nhiệt độ cao trên 320C và thấp dưới 150C sẽ làm cây tăng trưởng kém và hoa
dễ rụng.
Phân loại:
Giới

Plantae

Bộ

Solanales


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

Theo Than et al. (2008) trong trái ớt bao gồm nhiều chất hóa học bao gồm nhiều
loại dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoid, carotenoid, vitamin, protein, chất xơ và các
chất khoáng (Bosland và Votava, 2003). Trong ớt có nhiều thành phần quan trọng có
giá trị dinh dưỡng, hương vị, mùi thơm và màu sắc. Ớt có ít natri và cholesterol, giàu
vitamin A và C và là một nguồn cung cấp kali, axit folic và vitamin E. Ớt xanh tươi
chứa nhiều vitamin C hơn trái cam quýt và ớt đỏ tươi có nhiều vitamin A hơn cà rốt
(Osuna-García et al., 1998; Marin et al., 2004). Hai nhóm hóa chất được sản xuất bởi
ớt là capsaicinoid và carotenoids. Các capsaicinoid là alkaloid làm cho ớt có vị cay.
Một số lượng lớn carotenoid cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho ớt
(Britton và Hornero-Méndez, 1997; Hornero-Méndez et al., 2002; Pérez-Gálvez et al.,
2003).
Ngoài việc dùng trong thực phẩm, trái ớt còn được dùng trong y học và là cây
cảnh đẹp với nhiều màu sắc như các loại ớt ngũ sắc.

Hình 1: Một số loại ớt
(*Nguồn: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/Capsicum_annuum1.jpg,
ngày 02/08/2013)

2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt
Theo Than et al. (2008) bệnh thán thư, xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là
“than”, còn gọi là bệnh đốm trái hay nổ trái. Thán thư là tên gọi phổ biến dùng chung
cho cây trồng bị bệnh với triệu chứng bệnh là màu ngăm ngăm đen, tổn thương sâu và
có chứa các bào tử (Isaac, 1992). Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo ở
New Jersey, Mỹ bởi Halsted. Trong năm 1890, Halsted đã mô tả nguyên nhân gây ra
bệnh thán thư là hai loài Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum. Đơn vị


gloeosporioides var. minor, C.
gloeosporioides var. gloeosporioides
India

C. capsici

Maiti and Sen, 1979;
Paul and Behl, 1990

Indonesia

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Voorrips et al., 2004

Korea

C. acutatum, C. gloeosporioides, C.

Park and Kim, 1992

coccodes, C. dematium

Myanmar (Burma)

Gloeosporium piperatum E. and E., C.

Dastur, 1920

nigrum E. and Hals


Taiwan

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Manandhar et al., 1995

Thailand

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Than et al., 2008

UK

C. acutatum, Glomerella cingulata

Adikaram et al., 1983

USA

C. acutatum

Roberts et al., 2001

Vietnam

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides,

Don et al., 2007


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

bệnh và mô khoẻ thường có một đường vạch màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề
mặt mô bệnh có những chấm nhỏ màu đen đó là đĩa cành của nấm.
2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm
Theo Than et al. (2008) các loài Colletotrichum sp. sử dụng các cách khác nhau
cho sự xâm chiếm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở
vách dưới biểu bì (Bailey et al., 1992). Loài Colletotrichum sp. sản xuất một loạt các
cấu trúc xâm nhiễm chuyên hóa như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và
khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect và et al., 1999). Giai đoạn trước xâm nhiễm
của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nảy mầm trên bề mặt cây
trồng, sản xuất đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó thâm nhập vào các lớp biểu
bì (Bailey et al., 1992). Sau khi xâm nhập, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới
lớp biểu bì sống một cách hoại dưỡng và nhanh chóng lan rộng khắp các mô
(O'Connell et al., 1985). Không có giai đoạn ký sinh phát hiện trong hình thức hoại
sinh. Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự nhiễm dinh dưỡng hoại sinh vào
hình thức ký sinh bằng cách sống ở các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào.
Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó
sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey et al., 1992). Do đó các tác nhân
gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim et al, 2004). Ví dụ, C.
gloeosporioides trên bơ, ớt và chanh có thể sản xuất cả hai loại của sự xâm chiếm: ký
sinh trong tế bào ở giai đoạn đầu và hoại dưỡng (O'Connell et al., 2000).
Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài
Colletotrichum sp. trên ớt. Kim et al. (2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại sinh được tìm
thấy trong quá trình lây nhiễm của C. gloeosporioides trong ớt (C. annuum cv.
jejujaerae). Biểu bì tế bào chất của cây chủ trở nên cô đặc và nhỏ, không bào tăng lên
và phá hủy tế bào đến các tế bào dưới biểu bì của thực vật, trong đó có thể bị phá hủy

PP: Hình thành vòi xâm nhiễm

SH: Sợi nấm thứ cấp

ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot)

ScH: Dưới lớp biểu bì

PH: Sợi nấm sơ cấp.
Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm
nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm
màu sáng (ILS). Ở hình A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua
tế bào biểu bì của tế bào chủ và phòng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có
kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH). Sợi nấm này có thể định vị lan sang
các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên. Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm
này, sự tương tác giũa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc. Tiếp theo là giai đoạn
hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi mầm thứ cấp (SH).
Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào
đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ. Ở hình B, là cách
xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì
(ScH) và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013


2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp.
2.3.1. Phân loại
Giai đoạn vô tính :
Giới

Nấm

Ngành

Deuteromycotina

Lớp

Coelomycetes

Bộ

Melanconiales

Họ

Melaconiaceae

Chi

Colletotrichum

Giới



9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

2.3.2. Lịch sử nghiên cứu
Theo Phoulivong (2001) Colletotrichum lần đầu tiên được báo cáo bởi Tode
(1790) đặc tên là Vermicularia, nhưng sau đó đã được mô tả lại là Colletotrichum
(Corda, 1837) trong họ Melanconiales; lớp Coelomycetes; ngành Deuteromycotina.
Loài Colletotrichum sp. có đơn vị phân loại bao gồm chưa hoàn chỉnh hoặc nhóm vô
tính trong đó có một giai đoạn hữu tính Glomerella (Sutton, 1992). Colletotrichum sp.
bao gồm số lượng các loài gây bệnh sống trong mô thực vật, sống trên mô thực vật đã
chết, gần đây bệnh xuất hiện phổ biến trên một loạt các cây trồng có giá trị kinh tế cao,
cây cảnh (Cai et al., 2009; Hyde et al., 2009a; Prihastuti et al., 2009; Yang et al., 2009;
Phoulivong et al., 2010).
Bảng 2. Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp. nhiễm trên các cây
trồng nhiệt đới.
Trái cây

Một số loài Colletotrichum

Tài liệu trích dẫn

Lê tàu (avocado)


C. capsici,

Than et al., 2008a; Kim et al., 2009;

C. gloeosporioides

Ratanacherdchai et al., 2010.

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000 ; Chen et al.,

C. gloeosporioides

2005 ; Fischer et al., 2009 ;

Coffee

C. acutatum,

Nguyen et al., 2009; Prihastuti et

(Coffea arabica)

C. asianum,

al., 2009; Van der Vossen &

C. boninense,



Masyahit et al., 2009.

C. gloeosporioides

Alahakoon & Brown 1994;

(Hylocereus undatus)
Sầu riêng
(Durio zibethinus)

Pongpisutta and Sangchote 1994;
Freeman et al., 1996.

Cây ổi

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000 ; Alahakoon &

(Psidium guajava)

C. gloeosporioides

Brown 1994, Peres et al., 2002;
Amusa et al., 2006; Soares et al.,
2008.

Xoài


Đu đủ (Carica papaya)

C. acutatum,

Peres et al., 2002; Rahman et al.,

C. capsici và

2008.

(Garcinia mangostana)

C. gloeosporioides
Rose apple

C. gloeosporioides

Alahakoon & Brown 1994.

C. gloeosporioides

Farungsang et al., 1994; Sivakumar

(Syzygium jambos)
Chôm chôm
(Nephelium lappaceum)

et al., 1997; Wijeratnam et al.,
2008.


Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

2.3.3. Đặc điểm chung.
Colletotrichum sp. là một trong những chi nấm gây bệnh thán thư trên nhiều loại
cây trồng quan trọng, đặc biệt là các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới ảnh hưởng
đến nền kinh tế (Phoulivong, 2011).
Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) hiện nay nấm
Colletotrichum sp. được mô tả có 11 loài (Arx, 1957; Sutton, 1962). Nhưng
Alexopoulos và Mins (1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này đã
được mô tả trước đây, phần lớn chúng trùng tên. Theo ý kiến gần đây nhất của Baxter
et al., (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 11 loài: C. coccodes, C.
gloeosprioides, C. graminicola, C. capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư.
Khuẩn ty: Hệ khuẩn ty có gian bào và nội bào và ở mỗi tế bào chứa nhiều nhân.
Nhiều hạt dầu được sản xuất trong hệ khuẩn ty; khi chín khuẩn ty trở nên nhạt màu và
xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ lớp ngoài cùng. Khuẩn ty già đôi khi hình thành vách
dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospore), nó có
thể ở tận cùng hoặc chen giữa khuẩn ty nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách
ra chúng cũng mọc mầm để hình thành khuẩn ty mới. Nấm Colletotrichum sp. có hệ
khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển của khuẩn ty mảnh phân nhánh, không màu và có
vách ngăn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
Sinh sản: Collectotrichum sp. nội sinh, sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử

(*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm
Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong
quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật.
Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh
vật mà ta cần. Tùy điều kiện mà chúng ta chọn cách phân lập sao cho phù hợp.
Có nhiều cách phân lập nấm như: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử, phân lập bào tử
đơn độc, phương pháp pha loãng; phân lập từ bào tử đảm…
Phƣơng pháp dùng kim nhọn:
Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ
một cơ chất nào.
Cách thực hiện:

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

 Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ
phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp.
 Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất.
 Khử trùng que nhọn trên ngọn lửa đèn cồn.
 Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang


CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian
Từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013.
3.2. Địa điểm
Phòng Công nghệ gen thực vật và phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
3.3. Phƣơng tiện
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm


Ống nghiệm



Eppendorf 1,5 ml, 2.2ml.



Đĩa petri



Kim cấy



Que trải thủy tinh






Tủ cấy vô trùng Esco



Tủ ủ Binder



Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)



Máy ly tâm Eppendorf



Máy ly tâm chân không Eppendorf



Máy trộn mẫu (votex)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học