Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
i
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM sp.
GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ĂN QUẢ VÀ RAU MÀU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN NHẬT ANH
MSSV: 3103944
LỚP : VSVH K36
Cần Thơ, Tháng 05/2014
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
ii
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
iv
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã
nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban Giám Đốc
Viện, bạn bè và sự quan tâm ủng hộ của gia đình.
Trước tiên tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên
cứu nâng cao trình độ trong những năm qua.
Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã hết lòng dìu dắt, dạy dỗ và nâng
đỡ trong suốt thời gian học đại học. Cảm ơn cô đã chỉ dẫn và đồng hành từ đầu quá
trình thực hiện đến khi luận văn được hoàn thành một cách tốt đẹp.
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ sinh học đã
nổi phẳng hoặc lài, bìa dày, gợn sóng hoặc mỏng (chiếm 16,7%); cam nhạt, dạng
nhung mượt, độ nổi lài, bìa dày (chiếm 5,5%) và trắng hồng, dạng len xốp, độ nổi mô,
bìa mỏng sợi (chiếm 5,5). Về đặc điểm khuẩn ty và bào tử, tất cả 18 dòng nấm khuẩn
ty đều có vách ngăn ngang; có 7 dòng nấm có bào tử dạng hình trụ dài, nhọn hai đầu
và có nhiều giọt dầu trong tế bào chất (chiếm 38,9%); 9 dòng nấm có bào tử dạng
hình trụ ngắn (chiếm 50%); các dòng còn lại có dạng bào tử hình trụ, thuôn nhọn một
đầu (chiếm 11,1%).
Từ khóa: Bệnh thán thư, cây ăn trái, rau màu, Colletotrichum sp.
i
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
vi
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH BẢNG viii
DANH SÁCH HÌNH ix
TỪ VIẾT TẮT x
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Bệnh thán thư 3
2.1.1. Sơ lược bệnh thán thư 3
2.1.2.Tác nhân gây bệnh thán thư trên một số loại cây trồng 3
2.1.3. Triệu chứng 4
2.1.4. Cơ chế gây bệnh 5
2.2. Nấm Colletotrichum sp. 9
2.2.1 Giới thiệu chung 9
Bảng 1: Báo cáo về các loài Colletotrichum gây nhiễm trên trái cây nhiệt đới 13
Bảng 2: Công thức môi trường PDA 20
Bảng 3: Thuốc nhuộm Cotton blue 24
Bảng 4: Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine 24
Bảng 5: Dung dịch cố định mẫu acid lactic 25
Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của 18 dòng nấm Colletotrichum sp.
được phân lập 28
Bảng 7: Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 18 dòng nấm Colletotrichum sp.
được phân lập. 31 iv
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
ix
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Bệnh thán trên một số loại cây ăn quả và rau màu 3
Hình 2: Cơ chế gây bệnh của nấm (Phạm Văn Kim, 1999) 7
Hình 3: Sơ đồ mô tả cách phát triển bên trong mô cây đậu Hà Lan của nấm
Colletotrichum lindemuthianum (Phạm Văn Kim, 2003) 8
Hình 4: Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides 9
Hình 5: Khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp. được phân lập 27
Hình 6: Hình dạng bào tử của các dòng nấm Colletotrichum sp.
được phân lập 30
nhiều tiềm năng để phát triển. Về điều kiện tự nhiên, ngành trồng trọt nước ta thuộc hệ
sinh thái nhiệt đới và á nhiệt đới ẩm, ánh sáng dư thừa rất thuận lợi cho cây trồng phát
triển và trồng cấy nhiều vụ khác nhau trên các vùng của cả nước, cho phép mang lại
năng suất trên mỗi đơn vị diện tích. Song chính điều kiện tự nhiên nhiệt đới và á nhiệt
đới gió mùa, cùng với vị trí địa lý sát biển và địa hình phức tạp đã gây cho ngành trồng
trọt nước ta không ít khó khăn như: bão, lũ lụt, hạn hán, sâu phá hoại, và đặc biệt
nghiêm trọng là nấm gây bệnh cây. Thiệt hại của bệnh cây thể hiện rõ ở các mặt sau:
bệnh làm giảm năng suất cây trồng: do bị chết, do một số bộ phận thân cành, lá, củ,
quả bị hủy hoại. Cây bị bệnh sinh trưởng kém, còi cọc dẫn đến giảm năng
suất, Những thiệt hại kinh tế do bệnh cây những năm 90 của thế kỷ XX ước tính lên
đến 11,6%; trong đó nấm có tới hơn hàng chục ngàn loài, vi khuẩn hơn 600 loài và
hơn 1000 loài virus, tuyến trùng …Trong số hàng chục ngàn loài nấm gây bệnh cây thì
nấm Colletotrichum là một trong những chi phổ biến và quan trọng nhất của nấm gây
bệnh trên cây ở vùng nhiệt đới gió mùa như ở Việt Nam.
Theo xếp hạng của tạp chí Molecular Plant Pathology (2012) thì nấm
Colletotrichum được xếp ở vị trí thứ 8 trong 10 nấm gây bệnh cây hàng đầu. Hầu như
tất cả các cây trồng trên toàn thế giới thì dễ bị nhiễm một hoặc nhiều loài
Colletotrichum. Những loại nấm này gây ra các điểm cháy thán thư của các bộ phận
trên mặt đất của cây và gây thối sau thu hoạch. Các thành viên của chi này gây thiệt
hại lớn cho các cây trồng quan trọng, đặc biệt là cây ăn quả, rau màu và cây cảnh.
Thiệt hại do nấm Colletotrichum spp. bao trùm đến các cây lương thực quan trọng, bao
gồm chuối, sắn, lúa miến, được trồng bởi các nông dân tự cung tự cấp ở các nước đang
phát triển khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Đặc biệt nấm Colletotrichum như là
một tác nhân gây bệnh sau thu hoạch bởi sự xâm nhiễm tiềm ẩn, trước khi thu hoạch,
chúng không hoạt động cho đến sau khi trái cây được lưu trữ hoặc xuất hiện trên thị
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
2
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
trường. Lên tới 100% trái cây được lưu trữ có thể bị mất như là kết quả của bệnh
Colletotrichum (Prusky, 1996).
toàn thế giới, đặc biệt là ở các cây vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Sutton, 1992; Hyde
et al., 2009, 2010). (*Nguồn:http://www.kinhtenongthon.com.vn/Story/khoahoc/khuyennong/2011/7/29149
.html ) (ngày 3/8/2013)
2.1.2.Tác nhân gây bệnh thán thư trên một số loại cây trồng
- Thán thư trên xoài: Bệnh do nấm Colletotrichum gloeosporioides và
Colletotrichum acutatum gây ra.
(Nguồn:http://nnptntvinhphuc.gov.vn/index.php?action=details&&idmuc=CAQSBH02,
ngày 31/07/2013)
- Thán thư trên sầu riêng: Bệnh do nấm Colletotrichum zibethinum gây ra và có
cả Colletotrichum gloeosporiodes.
Hình 1: Bệnh thán trên một số loại cây ăn quả và rau màu
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
4
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
(Nguồn: http://www.dost-bentre.gov.vn/cay-trai-ben-tre/cay-say-rieng/1288-bnh-than-
th-do-nm-colletotrichum-zibethinum.html, ngày 31/07/2013).
- Bệnh thán thư trên măng cụt: Bệnh do nấm Colletotrichum gleosporiodes gây
ra.
(Nguồn: http://www.dost-bentre.gov.vn/cay-trai-ben-tre/cay-mang-cut/1295-bnh-than-
th.html, ngày 31/12/2013)
- Bệnh thán thư trên bưởi: Bệnh do nấm Colletotrichum gleosporioides gây ra.
teo lại, cháy khô.
Trên quả: Vết bệnh tròn, úng nước, màu nâu xám đến đen, lõm vào. Trừ các
quả thuộc họ bầu bí do chứa nhiều nước nên không nhìn rõ đặc trưng nơi vết bệnh.
Còn lại, trên các quả của các cây màu khác như cà chua, ớt vết bệnh điển hình cũng
có những đặc điểm đặc trưng như trên lá (vòng đồng tâm và hạt đen bóng li ti trong vết
bệnh). Quả bị bệnh sẽ ngừng phát triển và nhanh thối hỏng khi gặp ẩm hoặc cháy khô
khi nắng nóng.
(Nguồn:http://www.haiduong.gov.vn/vn/congdan/Pages/C%C3%A1chph%C3%B2ngtr
%E1%BB%ABb%E1%BB%87nhth%C3%A1nth%C6%B0h%E1%BA%A1iraum%C3
%A0u.aspx,)( ngày 22/07/2013)
2.1.4. Cơ chế gây bệnh
Giai đoạn tiền xâm nhiễm:
Chỉ có nấm là có hoạt động tiền xâm nhiễm đặc biệt. Ở một số lớn loài nấm bộ
phận hoạt động trong giai đoạn tiền xâm nhiễm là bào tử. Hoạt động tiền xâm nhiễm
của chúng là nảy mầm cho ra sợi nấm, sợi nấm phát triển để tìm nơi xâm nhập để xâm
nhập vào mô của ký chủ.
Giai đoạn xâm nhập vào mô của ký chủ:
Mầm bệnh có hai cách xâm nhập vào trong mô của ký chủ: xâm nhập thụ động
và xâm nhập chủ động.
- Xâm nhập thụ động: là mầm bệnh nhờ một tác nhân nào đó đưa mình vào sâu
bên trong mô của ký chủ chứ không tự mình tìm cách xâm nhập vào. Chẳng hạn như
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
6
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
côn trùng môi giới đưa trực tiếp các mầm bệnh vào trong mô của cây trong quá trình
chích hút. Các dụng cụ chăm sóc cây như dao kéo, có dính mầm bệnh, khi tạo nên vết
thương cho cây lành mạnh, sẽ đưa các loại bệnh này vào trong mô (Phạm Văn Kim,
1999).
Qua lỗ mở tự nhiên (thụ động): Một số loại nấm sẽ xâm nhập vào cây qua lỗ
mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng.
Sau khi đã xâm nhập vào khỏi hàng rào ngăn cản của ký chủ, mầm bệnh tìm
cách phát triển để gây bệnh cho ký chủ. Nấm có nhiều cách phát triển bên trong ký
chủ. Nấm Colletotrichum chỉ phát triển ở giữa các vách của hai tế bào ký chủ. Trong
quá trình phát triển chúng tiết ra enzyme và độc tố để phân hủy vách tế bào và nguyên
sinh chất của ký chủ.
Hình 2: Cơ chế gây bệnh của nấm (Phạm Văn Kim, 1999)
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
8
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
` (http://dc217.4shared.com/doc/N6rzN4Fd/preview.html)(ngày 13/07/13)
Giai đoạn hình thành và phát tán bào tử
(*Nguồn: http://agrouniversidad.blogspot.com/) (ngày 4/82013)
Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh,
phân nhánh, không màu và vách ngăn sợi nấm.
Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào và ở mỗi tế bào có nhiều nhân. Nhiều hạt
dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm; khi chín sợi nấm trở nên sậm màu
và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng.
Colletotrichum nội sinh, chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát
triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có
dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất
nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn kéo
dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt. Cùng với bào tử và cuống bào tử là
Hình 4: Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
10
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân
nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng và Frost (1964) mô tả một vài loài của
Colletotrichum có hoặc không có lông cứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ
ẩm.
Sự hình thành một số lớn của bào tử gây nứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều
kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình thành hệ sợi nấm.
Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không
(Zizyphus mauritiana), xoài (Mangifera indica), đu đủ (Carica papaya) và táo hồng
(Eugenia javanica) (Damm et al., 2009, Freeman et al., 1996, Kim et al., 2009). Loài
Colletotrichum có phổ rộng trên toàn thế giới và nó đã được chỉ ra rằng nhiều loài có
thể lây nhiễm sang cùng một cây chủ, trong khi một loài có thể lây nhiễm trên nhiều
cây chủ khác nhau (Cai et al., 2009, Hyde et al., 2009). Mối quan hệ nấm/cây chủ rất
rộng, không xác định và thường trùng lặp (Freeman et al., 1996), mặc dù các mối quan
hệ đang được xác định rõ hơn về sau. Người ta cũng tin rằng loài Colletotrichum có
thể thích ứng với các môi trường mới (Sanders và Korsten, 2003), dẫn đến vấn đề
nhiễm chéo nghiêm trọng trong sản xuất cây trồng.
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng bệnh thán thư và thối trái trên các loại trái
cây nhiệt đới chủ yếu là do C. gloeosporioides và ở một mức độ thấp hơn C. acutatum.
Tuy nhiên những kết quả này, dựa trên nhận dạng hình thái hoặc dữ liệu trình tự gen
đã được sử dụng để so sánh thường được thực hiện với tên áp dụng sai (Cai et al.
2009). Trong một bài báo gần đây của nấm bệnh thán thư trên trái cây nhiệt đới ở Thái
Lan (Phoulivong et al., 2010), người ta thấy rằng trong số các chủng nấm
Colletotrichum tìm được không có chủng nào là C. acutatum hoặc C. gloeosporioides.
Do đó, sự hiểu biết trước đó bệnh thán thư của hầu hết các loại trái cây nhiệt đới bị gây
ra bởi C. acutatum và C. gloeosporioides là không chính xác.
2.2.3 Các triệu chứng bệnh thán thư do Colletotrichum gây ra
Các triệu chứng nhiễm trùng gây ra bởi loài Colletotrichum thay đổi tùy theo
cây chủ và mô cây chủ (Waller, 1992), ví dụ: nhiễm trùng các bộ phận trên mặt đất của
cây như lá, các mô non và thân thường xuất hiện những vết bệnh đen, lõm, có hình
dạng gần tròn (thường được gọi là bệnh thán thư ). Hơn 1000 loài thực vật đã gặp vấn
đề với bệnh thán thư (Moriwaki et al., 2002). Colletotrichum cũng được biết là
nguyên nhân làm chết nhánh, thối rễ, đốm lá, rụng lá và tàn lụi lá cũng như tàn lụi cây
con (Jeffries et al., 1990;. Waller, 1992). Vết bệnh lan rộng, kết hợp lại và phá hủy khu
vực rộng lớn của lá, chúng thường xuất hiện ở bìa lá, làm cho lá quăn lại trong trường
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
12
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
nhiễm trên nhiều cây chủ như táo (Malus pumila), bơ (Persea americanna), chuối
(Musa sapientum), cà phê (Coffea arabica), họ cam quýt (Citrus spp.), Ổi (Psidium
guajava), táo tàu (Zizyphus mauritiana), chanh (Citrus aurentiforia), nhãn (Euphoria
Longana), đu đủ (Carica papaya), xoài (Mangifera indica), ô liu (Olea eupea), dâu tây
(Fragaria frageriae ), táo đường (Annona squamosa), cà chua (Lycopersicon
esculentum) (Bailey & Jeger., 1992, Simmonds 1965, Wharton & Deiguez-
Uribeondo., 2004). Tuy nhiên Colletotrichum falcatum lại có ký chủ đặc thù trên mía
đường (Saccharum officinale) (Kumar et al., 2010, Malathi et al., 2002). Có nhiều dữ
liệu trước đây về phổ ký chủ của loài Colletotrichum tuy nhiên nó phải được xem xét
một cách thận trọng (Freeman et al., 2000; Hyde et al., 2011). Nghiên cứu gần đây đã
chỉ ra rằng các loài phổ biến như C. gloeosporioides không phải là phổ biến ở các
vùng nhiệt đới như chúng ta đã nghĩ. Trong một nghiên cứu các loài Colletotrichum
gây bệnh thán thư ở Lào và Thái Lan không có loại trái cây nào bị nhiễm bởi C.
gloeosporioides. Trong thực tế, dữ liệu phân tử đã cho thấy rằng C. gloeosporioides là
một loài phức tạp bao gồm từ 20 đến 50 loài (Hyde et al., 2009). Do đó, nghiên cứu về
phổ ký chủ của loài Colletotrichum là một lĩnh vực cần nghiên cứu chuyên sâu và hầu
hết dữ liệu trước đó phải được xử lý một cách thận trọng (Hyde et al., 2011).
2.2.5 Một số loài Colletotrichum gây bệnh thán thư nghiêm trọng
trên cây trồng
a. Colletotrichum gloeosporioides
Theo Kim và cộng tác viên (2008) thì Colletotrichum gloeosporioides được biết
đến là nguyên nhân gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng. Nấm Colletotrichum
gloeosporioides có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Ở vùng nhiệt đới, nấm Colletotrichum gloeosporioides xuất hiện
trên hầu hết các loại cây trồng, giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm là sống hoại sinh trên
mô chết hoặc những tàn dư của cây trồng. Do đó, trong quá trình điều tra thường
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT
15
Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH
xuyên bắt gặp sự xuất hiện của nấm trên đồng ruộng (Waller, 1992). Phạm vi ký chủ
1991; Sreenivasaprasad và Talhinhas, 2005), nó rất khó phân biệt với Colletotrichum
gloeosporioides cả về đặc điểm hình thái và phổ cây chủ (Wharton and Diéguez-
Uribeondo., 2004). Các nhóm Colletotrichum acutatum khác nhau thì được phân biệt
Copyright: Tài liệu đại học ©