TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
----------

NGUYỄN THỊ CHUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
KOMBUCHA TỪ TRÀ PHÚ THỌ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên nghành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiên đề tài: “Nghiên cứu
ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà
Phú Thọ”, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình, quý báu của các
thầy cô giáo, các anh chị và các bạn.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hƣớng dẫn, dạy bảo, động
viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để
em thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 2
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................. 3
6.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 3
6.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 3
7. Đóng góp của đề tài .............................................................................. 3
N I DUNG .................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................... 4
1.1. Tổng quan về kombucha .................................................................... 4
1.1.1. Sơ lƣợc về kombucha ..................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ............................................................................ 6
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha ....................................................... 7
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic ......................................................................... 7
1.1.3.2. Nấm men .................................................................................. 8
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic ....................................................................... 10
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ......................... 11
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha .................. 13
1.1.5.1. Thành phần hóa học của trà Kombucha .................................. 13
1.1.5.2. Công dụng của Kombucha...................................................... 14
1.1.5.3. Một số lƣu ý khi sử dụng trà ................................................... 15
1.2. Một số đặc điểm về trà Phú Thọ ...................................................... 16
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ...................... 16


2.2.4. Phƣơng pháp toán học .................................................................. 29


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 30
3.1. Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà
Phú Thọ ............................................................................................ 30
3.1.1. Phân lập ........................................................................................ 30
3.1.2. Hình thái tế bào của các chủng nấm men, vi khuẩn trên kính
hiển vi .................................................................................................... 31
3.1.2.1. Hình thái tế bào của vi khuẩn ................................................. 31
3.1.2.2. Hình thái tế bào của nấm men ................................................ 32
3.1.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập
đƣợc ....................................................................................................... 32
3.1.4.1. Khả năng oxy hoá acid acetic ................................................. 32
3.1.4.2. Kiểm tra hoạt tính catalase ..................................................... 33
3.1.4.3. Khả năng sinh sắc tố nâu ........................................................ 33
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha từ trà Phú Thọ ................................................................. 34
3.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men
kombucha ............................................................................................... 34
3.2.1.1. Xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra của mỗi
chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn ............................. 34
3.2.1.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha đƣợc lên men từ 4
chủng vi khuẩn ....................................................................... 35
3.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men
kombucha ............................................................................................... 36
3.2.2.1. Hoạt lực lên men .................................................................... 36
3.2.2.2. Đánh giá cảm quan chất lƣơng trà kombucha đƣợc lên men
từ 4 chủng nấm men ............................................................... 36


Bảng 3.3. Hàm lƣợng CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng
nấm men ..................................................................................... 36
Bảng 3.4. Chất lƣợng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng nấm men ... 36
Bảng 3.5. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1
(x106 tế bào) ............................................................................... 37
Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2 (x106 tế bào) ........ 39
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của t lệ giống tới quá trình lên men kombucha.......... 41
Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men
kombucha ................................................................................... 44
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH ban đầu tới quá trình lên men kombucha ....... 47


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. “Con nấm” (SCOBY) .................................................................... 7
Hình 1.2. Cơ chế phân giải đƣờng trong tế bào nấm men ............................. 11
Hình 1.3. Hình ảnh trà Phú Thọ .................................................................... 16
Hình 3.1. Mẫu phân lập nấm men ................................................................. 30
Hình 3.2. Mẫu phân lập vi khuẩn.................................................................. 30
Hình 3.3. Chủng vi khuẩn K1 trên môi trƣờng thạch nghiêng ...................... 31
Hình 3.4. Chủng vi khuẩn K4 trên môi trƣờng thạch nghiêng ...................... 31
Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K1 ....................................... 31
Hình 3.6. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K2 ....................................... 31
Hình 3.7. Hình thái tế bào của chủng nấm men N1....................................... 32
Hình 3.8. Hình thái tế bào của chủng nấm men N3....................................... 32
Hình 3.9. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter ................................. 33
Hình 3.10. Chuẩn độ acid dịch lên men kombucha ....................................... 34
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng Acetobacter K1 .... 38
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2 ..... 39
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các t
lệ giống khác nhau ........................................................................ 41

3. SCOBY

Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4. NADP

Nicotiamide adenine

5. Nxb

Nhà xuất bản

6. TCVN

Tiêu chuẩn Việt nam

7. TS

Tiến sĩ


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đối với ngƣời dân Việt Nam, việc sử dụng trà đã trở thành một thói
quen từ rất lâu đời. Uống trà không ch để giải khát, mà còn để phòng bệnh,
nâng cao sức khỏe, kéo dài tuổi thọ… Trên thị trƣờng có rất nhiều loại thức
uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng dòng sản phẩm lên men còn rất mới mẻ đối
với thị trƣờng tiêu dùng Việt Nam.
Trà


kombucha tốt từ trà Phú Thọ. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng
thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha
3.2. Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha
3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, nấm
men đã tuyển chọn
3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha
3.5. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha
3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng giống tới quá trình lên men kombucha
3.7. Xây dựng quy trình lên men kombucha trong phòng thí nghiệm
4. Đ i tƣ ng và ph m vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà
Phú Thọ.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp vi sinh: Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và
quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phƣơng pháp đếm số
lƣợng tế bào vi sinh vật; phƣơng pháp bảo quản chủng giống; Phƣơng pháp
xác định hoạt lực lên men của nấm men…
Phƣơng pháp hóa sinh: Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng
oxy hoá acid acetic; phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng
chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1

2

làm ch thị….


Phƣơng pháp toán học.
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Kombucha thật ra là một hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và
vi khuẩn. Từ 1928, Hermann đã ghi nhận việc định danh 2 chủng men
Bacterium xylinum và B. xylinoides và một vi-khuẩn B gluconicum (đƣợc đặt
tên do ở khả năng chế tạo gluconic acid). Các nhà nghiên cứu sau đó đã xác
định Kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum, cùng
các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces,
tạo thành một khối nhƣ tổ chim: Những chủng vi sinh vật và nấm men sau đây
đã đƣợc tìm thấy trong Kombucha: Acetobacter ketogenum, Pichia fermentans,
Saccharomyces apiculatus, S.ludwigii, B.xylinoides, Schizosaccharomyces
pombe và Acetobacter ketogenum (theo List, P.H & L.Horhammer.1973
Hagers Hand buck der Pharmazeutischen Praxis . NewYork: Sprin ger-Verlag).
Khi các vi-sinh vật đƣợc nuôi trong một môi trƣờng trà dƣợc, cung cấp
đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dƣỡng căn bản
khác nhƣ đƣờng. Chúng phát triển và biến đổi đƣờng thành gluconic acid,

4


đồng thời sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi
thành acetic acid (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua
của rƣợu táo lên men. Thành phẩm „trà‟ sau cùng chứa trung bình từ 0.5 đến
1% alcohol, một lƣợng nhỏ lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và
oxalic acid. Lƣợng các Vitamin B trong thành phẩm khá cao. Ngoài ra trong
môi trƣờng lên men còn có thể có hyaluronic acid, chondroitin-sulfate acid,
mukoitin sulfate, heparin [27].
Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy:
kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid
acetic [19], [21], [24]. Các vi khuẩn acetic chính đƣợc tìm thấy trong các loại
nấm trà: Acetobacter xylinum [14], Acetobacter aceti, Acetobacter
pasteurianus [23], Gluconobacter oxydans [18], [22].

và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có
thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium
gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là
Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter
xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh
với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp,
thƣờng đƣợc gọi là “con nấm” hay SCOBY. Kombucha sinh trƣởng tốt trong
môi trƣờng nƣớc trà đƣờng, thƣờng đƣợc sử dụng để lên men dung dịch trà
đƣờng. Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên
bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai
(thƣờng gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu (“nấm mẹ”).
Hình dạng và kích thƣớc của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

6


Hình 1.1. “Con nấm” (SCOBY)
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng
rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất,
nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, dấm, rƣợu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài
thuộc giống Acetobacter đã đƣợc phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có
ý nghĩa kinh tế. Đặc điểm chung của chủng Acetobacter.
Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trƣờng
nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái
khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra.
Kích thƣớc thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0µm).

tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác
nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào
nấm men cũng nhƣ nhiều loại tế bào khác đƣợc cấu tạo chủ yếu từ các phần
cơ bản sau:
Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Chủ yếu là:
glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác nhƣ kitin,
volutin,…

8


Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp nhƣ protein,
phospholipit enzyme permeraza…
Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nƣớc, protit, gluxit,
lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó.
Nhân tế bào
Những bào quan khác: không bào, ty lạp thế, riboxom,… [5].
* Sự sinh sản của nấm men.
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy
chồi; Sinh sản bằng cách phân đôi; Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào
tử: Tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính.
* Phân lo i nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti)
Lớp nấm men thật (Ascomyces): Phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) bao gồm giống: Crytococus
(toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula.
* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Nấm men cũng nhƣ các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon,

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dƣỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá
trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trƣờng acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ
hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên
men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác
nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.

10


1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha
Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:
* Lên men ethanol

Hình 1.2. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Lên men rƣợu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đƣờng lên men thành ethanol và CO2. Quá trình
lên men rƣợu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự
có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển
đƣờng thành rƣợu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh

11


dƣỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học
trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rƣợu và CO2). Sau

CH3CHO + H2O →
CH3CH(OH)2 + O2

CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)
→ CH3COOH + H2O

* Lên men lactic:
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lƣợng. Các phân tử ATP
đƣợc hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ đƣợc vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trƣởng của vi sinh
vật. Ngƣợc lại, các sản phẩm nhƣ acid lactic, ethanol, CO2 đƣợc vi khuẩn thải
vào môi trƣờng lên men. Kết quả là hàm lƣợng acid lactic tích lũy trong môi
trƣờng lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trƣờng và kéo theo những
biến đổi hóa lý khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đƣờng thành acid
lactic nhờ vi sinh vật.
Phƣơng trình phản ứng:
C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal
Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men
đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men
còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung
gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men.
Phƣơng trình tổng quát:
C6H12O6  CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + COOH(CH2)2COOH + CO2

Lƣợng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, vào môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid
lactic thƣờng chiếm 40

lƣợng đƣờng đã đƣợc phân hủy, acid succinic 20%,


g/l

Oxalic Acid

0,01

g/l

Caffeine

0,065

g/l

Vitamin B1

0,74

g/l

Vitamin B6

0,52

g/l

Vitamin B12

0,84



14