TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

LÊ THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG RƠM RẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh
Thị Kim Nhung và các thầy cô, chuyên viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật,
tổ Thưc vật – Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa
luận trong thời gian qua.
Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn nghiên cứu tại phòng
thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè luôn sát cánh,
động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian làm khóa luận.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................. 2
5. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 3
CHƢỚNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose .................................. 4
1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose ......................................................... 4
1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose ................................................. 6
1.1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin .............................................................. 6
1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam ............................................... 7
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên ............................. 8
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên .......................................... 8
1.3.2. Cellulose ........................................................................................... 8
1.3.3. Hemicellulose ................................................................................. 10
1.3.4. Lignin ............................................................................................. 10
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose.................................................. 11
1.4. Thành phần chính của rơm rạ ............................................................... 14
1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh ...................................................... 14


1.5.1. Trên thế giới ................................................................................... 14
1.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 16
2.2. Hóa chất, thiết bị ................................................................................... 16
2.2.1. Hóa chất.......................................................................................... 16
2.2.2. Thiết bị ........................................................................................... 16
2.3. Các loại môi trường nuôi cấy ............................................................... 16
2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA ............................................ 16
2.3.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn Gauze I ....................................... 17
2.3.4. Môi trường giữ giống nấm mốc Crapeckdox ................................ 17
2.3.5. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU

: Colony forming unit

CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

ĐC

: Đối chứng

G

: Gram

MPA

: Meat peptone agar

MT

: Môi trường

PTN

: Phòng thí nghiệm


: Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ ..................................................... 14
Bảng 1.2. Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ ......................................... 14
Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose ................................. 17
Bảng 3.1. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu ......... 25
Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme của tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu ....................... 32
Bảng 3.3. Vi sinh vật bổ sung vào mỗi khối ủ thí nghiệm .............................. 34
Bảng 3.4. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ ........................................ 35
Bảng 3.5. Độ giảm khối lượng của các khối ủ sau 32 ngày............................ 36


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose .......................................................... 9
Hình 3.1. Hoạt tính của một số chủng tuyển chọn .......................................... 26
Hình 3.2. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường MPA . 27
Hình 3.3. Hình thái tế bào các chủng vi sinh vật nghiên cứu (x1000) ........... 27
Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi soi nổi ............. 28
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn (x 1000) ..... 29
Hình 3.6. Khuẩn lạc các chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa ............. 29
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC .......................... 31
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất bột giấy ...................... 31
Hình 3.9. Khối ủ thí nghiệm và đối chứng sau khi phối trộn nguyên liệu ..... 33
và bổ sung giống vi sinh vật ............................................................ 33
Hình 3.10. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ lớn ........................ 35

1


khả năng phân giải cellulose, lignin và hemicellulose nhờ có hệ enzyme ngoại
bào. Do đó tôi chọn đề tài:“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi
sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng
phân hủy cellulose trong rơm rạ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năng
sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu
3.2.Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân
hủy cellulose trong rơm rạ
3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng
vi sinh vật nghiên cứu
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài nhằm nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật có
khả năng sinh enzyme cellulase. Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu
về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng
trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Việc nghiên cứu này nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi sinh vật có
hoạt tính phân giải cellulose cao để xử lý nhanh rơm rạ, rút ngắn quá trình ủ,
nhằm hạn chế nguồn sâu bệnh, tạo nguồn phân bón hữu cơ từ rơm rạ, bón trở lại
cho ruộng đồng, góp phần nâng cao dinh dưỡng đất, giảm thiểu ô nhiễm môi
trường.


wentii,

Aspergillus

fumigatus,

Trichoderma

reesei,

Fusarium

solani,

Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [8].
Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme
bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính
cellulase của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất
cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9].
b) Vi khuẩn
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi
sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX
(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng
4


này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một
vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế
bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga,
Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lượng khi oxy hoá

cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều
nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men,
pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ khuẩn
thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử
5


của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi
và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn
khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử
diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9].
Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh
Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose
và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên
nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng Streptomyces
antibioticus và Streptomyces sp. với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C
và pH tối thích là 5,9 [9].
1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose
Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan
là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên. Các tác giả cho rằng nhiều vi
sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả hemicellulase.
Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes,
Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium.
Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp
xylanase. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus
oryzae,

A.niger,

A.wentti,



1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam
Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ.
Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn
rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây
lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến
bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa. Sau
khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều
công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế, rơm rạ phần
lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa về nhà để làm
thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân
đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực
tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ
(đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm không khí rất có hại
đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh
đường hô hấp.
Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng
rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu…
Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy
đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc
ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ
dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép rơm đã
được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố
Hồ Chí Minh... Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được
áp dụng rất ít ở nước ta.
Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi
sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón. Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người
dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An.
Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây

Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành
phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose. Các gốc này nối với nhau nhờ liên
8


kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ
vài trăm đến 15000) trung bình là 3000. Các đơn phân glucoza trong cellulose
thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1). Trong công thức phối cảnh, biểu diễn
glucoza số chẵn, quay góc 180o so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều
nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11].

H

H

H

CH2OH
O

OH

O
H
HO

HO

H



9


có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ
phân cellulose [9].
1.3.3. Hemicellulose
Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng.
Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với
cellulose. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường. Các gốc đường được nối
với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn
và phân nhánh.
Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ
bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi
hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải
bởi enzyme hemicellulase.
Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ,
trấu. Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên.
Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng

(20

- 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11].
1.3.4. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu
trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic. Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại
rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau.
Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và CC. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7].
Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic.
Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế

hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:
Exo-β(1,4)-glucanasehay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt chuỗi
cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzyme này không
thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl cellulose)
nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính
của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên được cellulose
kết tinh.
11


Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 β-D-glucano-hydrolaza): Enzyme
này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử cellulose một
cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và glucose. Enzyme
này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên
cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose. Chính nhờ sự phân cắt
trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzyme
xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose kết tinh.
Enzyme β-1,4-glucozidasehay xenlobiase: Đây là những enzyme rất đặc
hiệu. β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit mạch
ngắn thành glucose. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose phụ thuộc
chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase. Tuy nhiên theo một số tác giả
cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra theo một trật tự
khác nhau.
b) Cơ chế thuỷ phân cellulose
Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là
không đặc hiệu. Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên.
Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động trương nở
có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạo
thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9].
Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme

ligninase. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là
một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các
nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ
vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham
gia vào quá trình thuỷ phân lignin. Ligninase không thuỷ phân lignin thành các
tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì lignin
chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninase lại
rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với
lignin.

13


1.4. Thành phần chính của rơm rạ
Tại thời điểm thu hoạch, hàm lượng ẩm của rơm rạ thường cao tới 60%,
tuy nhiên trong điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ có thể trở nên khô nhanh đạt
đến trạng thái độ ẩm cân bằng vào khoảng 10 - 12%. Rơm rạ, có hàm lượng tro
cao và lượng protein thấp [13]. Trong rơm rạ chứa lượng lớn các chất hóa học
và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2. và 1.3. [14].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ
Các chất hóa học

Rơm rạ (%)

Cellulose

32 – 47

Hemicelluose

1.8

Galactose

0.4

Arabinose

2.7 – 4.5

1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh
1.5.1. Trên thế giới
Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm
được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống
được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao năng
xuất, chất lượng nông sản. Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến
con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
14


Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và
được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ (
1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).
Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do
Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón
cho các loại cây thích hợp họ Đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh
cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích
khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp. , Azotobacter

Phân lập, tuyển chon một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ
thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà nội 2.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
Giấy lọc, thuốc thử lugol 1%, côngô đỏ 1%. Các hóa chất: NaNO3,
MgSO4.7H2O, KCl, K2HPO4, FeSO4, NaCl, NH4Cl, (NH4)2 SO4, CaCO3,
saccarose, cao thịt, pepton... các hóa chất thông dụng khác.
2.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), box vô trùng
(Haraeus), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), micropipet Jinson (Pháp)
các loại từ 0.5 μl – 10 ml, máy so màu UV – vis (Nhật), máy đo pH (MP 200R Thuỵ Sĩ), cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ), kính hiển vi quang học Carl Zeiss
(Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que
trang, lamen, đèn cồn... và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.3. Các loại môi trƣờng nuôi cấy
2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA
Peptôn : 5g;

Thạch agar : 20g;

Cao thịt : 5g;

NaCl

: 5g;

16

Nước : 1000ml.