ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Mai Hiên

NGHIÊN CỨU HỆ ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT Ở NHIỆT ĐỘ THẤP
ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT CỒN
TỪ NGUYÊN LIỆU GIÀU TINH BỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Mai Hiên

NGHIÊN CỨU HỆ ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT Ở NHIỆT ĐỘ THẤP
ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT CỒN
TỪ NGUYÊN LIỆU GIÀU TINH BỘT

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 60.42.0107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CBHD: TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN

1.3.1 Sản xuất cồn theo công nghệ truyền thống ....................................... 14
1.3.1.1 Quá trình nghiền nguyên liệu ................................................. 14
1.3.1.2 Quá trình nấu nguyên liệu...................................................... 15
1.3.1.3 Quá trình thuỷ phân nguyên liệu ............................................ 15
1.3.1.4 Quá trình lên men .................................................................. 16
1.3.1.5 Quá trình chưng cất và tinh chế ............................................. 17
1.3.2 Một số tiến bộ trong sản xuất cồn từ nguyên liệu giàu tinh bột.......... 17
1.4 CÁC ENZIM THỦY PHÂN TINH BỘT Ở NHIỆT ĐỘ KHÔNG CAO 19
1.4.1 Hệ enzim thuỷ phân tinh bột sống ở nhiệt độ thường (Stargen 001) .. 19
1.4.2 Enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thấp .......................................... 21
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 23
2.1 NGUYÊN LIỆU ........................................................................................ 23


2.1.1 Sắn ................................................................................................... 23
2.1.2 Gạo ................................................................................................... 23
2.1.3 Enzim ............................................................................................... 23
2.1.4 Nấm men .......................................................................................... 23
2.1.5 Hoá chất ........................................................................................... 24
2.1.6 Dụng cụ và thiết bị............................................................................ 24
2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................................................................. 24
2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy ................... 24
2.2.2 Xác định hàm lượng chất khô ........................................................... 25
2.2.3 Đo pH ............................................................................................... 25
2.2.4 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Graxianop ......... 25
2.2.5 Xác định thành phần dịch đường ...................................................... 26
2.2.6 Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng HCl..26
2.2.7 Xác định độ rượu trong giấm chín..................................................... 27
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT LÊN MEN .......................... 29
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 31

hóa .................................................................................................... 55
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 59


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng cồn nhiên liệu của một số nước/vùng trên thế giới
Bảng 1.2: Sản lượng cồn của một số nhà máy sản xuất cồn có sản lượng lớn
Bảng 3.1: Thành phần nguyên liệu
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát công nghệ sản xuất cồn của nhà máy Rượu Hà Nội
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung nấm men đến hiệu quả quá trình
đường hoá và lên men đồng thời
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ enzim Stargen 001 đến quá trình đường hoá và
lên men đồng thời
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát công nghệ sản xuất cồn của nhà máy Rượu Đồng Xuân
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát công nghệ sản xuất cồn sử dụng enzim dịch hóa
Spezyme Extra và enzim đường hóa Dextrozyme GA
Bảng 3.7: Thông số công nghệ của quy trình sản xuất cồn từ sắn sử dụng Spezyme
Extra và Distillase L-400
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian dịch hoá tới khả năng thuỷ phân
tinh bột của enzim Spezyme Extra
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian dịch hoá đến hiệu quả quá trình
thủy phân sắn lát bằng enzim Spezyme Extra và Dextrozyme GA
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ enzim Spezyme Extra đến quá trình dịch hóa


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sản lượng cồn của một số nước/vùng trên thế giới qua các năm


Ethyl alcohol (etylic) hay được gọi là cồn, có công thức hoá học là C2H5OH,
có vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp (như công nghiệp nặng, công
nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm…), nông nghiệp, y tế. Cồn là nguyên liệu để
pha chế nhiều loại đồ uống phổ biến ở nhiều nước; cồn còn được dùng để sản xuất
nhiều loại hoá chất quan trọng như: axetaldehyt, axit axetic, các este, butanol,
glycol, vinyl axetat [6]… Những năm gần đây sản xuất cồn được xem là hướng ưu
tiên số một làm nhiên liệu để thay thế xăng ở các nước phát triển nhất là Brazil, Mỹ
và một số nước khác như Trung Quốc, Thái Lan…
Ngành công nghiệp sản xuất cồn đã có từ rất lâu đời. Kể từ năm 1800 khi
nhà máy sản xuất cồn đầu tiên ở Hà Lan được xây dựng [6], thì cho tới nay có hàng
loạt nhà máy đã được xây dựng ở nhiều nước trên thế giới. Tính đến năm 2006,
tổng sản lượng cồn trên thế giới đã đạt tới con số 51 tỷ lít [25]. Trên thế giới cồn
được sản xuất theo hai con đường. Thứ nhất là lên men truyền thống từ các nguyên
liệu thô như rỉ đường (là phế phẩm của nhà máy sản xuất đường từ mía hay củ cải
đường) hoặc thuỷ phân các nguyên liệu có chứa tinh bột như ngô, lúa mạch, gạo…
hoặc từ sắn để thu lấy dịch đường rồi cho lên men và chưng cất. Thứ hai là tổng hợp
từ etylen. Xét về hiệu quả kinh tế thì phương án thứ hai có lợi thế hơn vì nguyên
liệu rẻ tiền. Nhưng xét về mặt chất lượng sản phẩm và khả năng đáp ứng về công
suất sản xuất và trang thiết bị đơn giản thì phương pháp lên men từ gluxit chiếm ưu
thế hơn nhiều. Hiện nay trên thế giới 95% cồn được sản xuất theo phương pháp lên
men, chỉ có 5% được sản xuất theo con đường tổng hợp hoá học [10].
Quá trình sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu có chứa tinh bột như gạo, ngô,
khoai, sắn…là một trong các quá trình công nghệ đã được biết đến từ lâu và phát
triển qua hàng thế kỷ. Công nghệ này đặc biệt phát triển với các nước có sản lượng
cây lương thực dồi dào như Brazil, Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc…Việt Nam là nước
nằm ở vùng nhiệt đới, rất thích hợp cho việc trồng các cây lương thực như lúa, ngô,

1


2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CỒN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.1.1 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới
Cồn etylic có vai trò quan trọng trong nhiều ngành, là nguyên liệu để sản xuất
hơn 150 loại sản phẩm khác nhau. Có thể tóm tắt vị trí của cồn etylic trong các
ngành công nghiệp như sau [6]:
 Quốc phòng: thuốc súng không khói và nhiên liệu hoả tiễn bom bay.
 Y tế: sát trùng và pha chế thuốc.
 Thực phẩm: rượu mùi, giấm.
 Nông nghiệp: thuốc trừ sâu.
 Dệt: thuốc nhuộm, tơ nhân tạo.
 Chế biến gỗ: sơn, vecni.
 Giao thông vận tải: làm nhiên liệu.
 Công nghiệp nặng: công nghiệp cao su tổng hợp.
 Công nghiệp hoá chất: dung môi hữu cơ.
 Công nghiệp khác: đồ nhựa, keo dán, hương liệu…
Khi cuộc khủng hoảng năng lượng diễn ra gay gắt vào những năm của thập
niên 70 (thế kỷ 20), người ta nghĩ ngay đến một nguồn cung cấp năng lượng khác
để thay thế dầu mỏ. Nguồn đầu tiên người ta nghĩ đến là cồn etylic. Cồn kỹ thuật là
nhiên liệu cho ô tô và các động cơ rất ưu việt. Đặc biệt trong những năm đầu thế kỷ
21, khi giá dầu thô ngày càng tăng cao thì cồn và nhiên liệu sinh học đã trở thành
một trong những ưu tiên hàng đầu trong những định hướng chiến lược nghiên cứu
về năng lượng của nhiều quốc gia phát triển trên thế giới. Braxin đã sử dụng cồn để
pha vào xăng với tỷ lệ đến 20% dùng trong giao thông vận tải. Tại Mỹ, luật pháp

3

10938.00 13298.00 13948.00 13300.00 13300.00

Brazil

5019.20

6472.20

6578.00

6921.54

5573.24

5577.00

6267.00

Europe

570.30

733.60

1040.00

1208.58

1167.64


462.30

449.00

523.00

Phần còn
lại của
thế giới

315.30

389.40

914.00

984.61

698.15

752.00

1272.00

Thế giới

2009

2010



thành nhà máy rượu Hà Nội với năng suất 6 triệu lít/năm, nhằm cung cấp chủ yếu
cho nhu cầu uống cho nhân dân và một phần dành cho xuất khẩu sang các nước
Đông Âu. Kể từ đó đến nay, các công đoạn trong công nghiệp sản xuất cồn liên tục
được đổi mới và hiện đại hoá nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm.
Tuy nhiên, ở Việt Nam rượu etylic sản xuất hầu như chỉ phục vụ cho ngành
công nghiệp thực phẩm, các ngành khác còn hạn chế. Trong khoảng thời gian
những năm cuối thế kỷ 20, sau khi các nước Đông Âu tan rã, công nghiệp sản xuất
rượu cồn ở Việt Nam gặp không ít khó khăn do thị trường tiêu thụ bị thu hẹp. Tuy
nhiên đến những năm đầu thế kỷ 21, ngành công nghiệp sản xuất cồn lại được chính
phủ chú trọng đầu tư cả về mặt vốn đầu tư và thiết bị, công nghệ tiên tiến hiện đại
[3]. Chính vì thế mà sản lượng cồn của các nhà máy sẽ ngày càng tăng cao. Sản
lượng cồn của một số nhà máy có công suất lớn ở Việt Nam hiện nay được thể hiện
ở bảng 1.2.

Bảng 1.2: Sản lượng cồn của một số nhà máy sản xuất cồn có sản lượng lớn [22]

STT

Công suất

Nguyên liệu

(triệu lít/năm)

sử dụng

12,00

Ngũ cốc


7

Công ty đường Bình Hòa

3,0

Mật rỉ

8

Công ty rượu Bình Tây

6,0

Mật rỉ và Ngũ cốc

6


Khi nhà máy cồn số 2 của Công ty cổ phần đường mía Lam Sơn (Thanh
Hóa) đi vào hoạt động đã bổ sung công suất khoảng 25 triệu lít/ năm. Như vậy tính
đến năm 2005 sản lượng cồn của Việt Nam đạt khoảng 50 triệu lít và cn số này đến
năm 2012 đã vào khoảng 60 triệu lít.
Sản lượng cồn của Việt Nam trong những năm tới cũng sẽ không ngừng
tăng. Do hiện nay ở Việt Nam việc nghiên cứu sản xuất cồn sinh học đã được đề
cập và triển khai. Ngày 20/11/2007, thay mặt thay mặt Thủ tướng Chính phủ, Phó
Thủ tướng Chính phủ Hoàng Trung Hải đã ra Quyết định số 177/2007/QĐ-TTG phê
duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025".
Mục tiêu chủ yếu của Đề án là phát triển nhiên liệu sinh học góp phần bảo đảm an

lượng mật rỉ này không chỉ cung cấp cho các nhà máy sản xuất cồn mà còn là nguồn
nguyên liệu chính cho các nhà máy sản xuất axít glutamic, sinh khối nấm men.
Ngoài ra, giá thành sản xuất cồn tại các nhà máy sản xuất từ rỉ đường cũng thường
xuyên biến động. Nhìn chung giá bình quân của cồn sản xuất từ mật rỉ là khá cao.
Vả lại giá cồn còn phụ thuộc vào giá mật rỉ và chi phí nhiên vật liệu. Do vậy với
mục tiêu trong giai đoạn tới là sản xuất cồn với giá thành rẻ để pha vào xăng nhằm
hạ giá thành cho nhu cầu năng lượng của người dân thì rỉ đường chưa thực sự là
nguồn nguyên liệu tối ưu cho quá trình sản xuất.
1.2.2 Nguyên liệu xenluloza
Xenluloza là một nguồn nguyên liệu dồi dào và có tiềm năng lớn cho ngành
sản xuất cồn. Nguyên liệu xenluloza có khả năng tái tạo nhanh, giá rẻ và có thể tận
dụng được nguồn phế thải của ngành nông nghiệp hay ngành chế biến nông sản
thực phẩm. Tuy nhiên nguyên liệu xenluloza được cấu trúc bởi các lớp xenluloza,
hemixenluloza và lignin rất bền. Vì vậy quá trình biến đổi xenluloza thành đường

8


có khả năng lên men là rất hạn chế, năng suất cồn vẫn còn thấp [17, 20]. Do đó để
xenluloza trở thành nguồn nguyên liệu chính cho quá trình sản xuất cồn thì cần có
nhiều nghiên cứu kỹ lưỡng hơn.
1.2.3 Nguyên liệu giàu tinh bột
Có rất nhiều nguyên liệu có hàm lượng tinh bột khá cao được ứng dụng trong
quá trình sản xuất cồn như ngô, gạo, lúa mỳ, đại mạch, khoai tây, khoai lang...Mỗi
vùng mỗi quốc gia lại sử dụng loại nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất cồn
như: khoai tây là một trong những nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất cồn ở các
nước châu Âu; hay ngô lại là nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp cồn của Mỹ,
sắn là nguyên liệu chính cho ngành sản xuất cồn của Thái Lan...Còn đối với Việt
Nam nguyên liệu chính cho quá trình sản xuất cồn là sắn, gạo, một phần ngô và
khoai.

các loại rượu có chất lượng cao với đủ loại hương vị khác nhau…
Hạt tinh bột gạo có kích thước từ 2 – 10 µm, màu trắng đục và có dạng hình
đa giác. Thành phần chủ yếu của gạo là tinh bột (70-80%), protein (8-12%), chất
béo (0,4-0,6%), xenluloza (0,6-0,8%). Độ ẩm của gạo thường trong khoảng 11%
[6]. Tinh bột gạo gồm hai thành phần: amiloza chiếm từ 13 – 35%, amilopectin
chiếm khoảng hơn 65% tuỳ thuộc vào từng loại gạo. Nhiệt độ hồ hoá của tinh bột
gạo nằm trong khoảng 70 – 80oC [5].

10


Sắn
Sắn là cây lương thực đứng hàng thứ sáu trên thế giới và là một trong 15 cây
trồng chiếm diện tích lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của loài người. Cây sắn
có nhiều ưu điểm như: cây sử dụng tốt những đất đã kiệt, sản lượng ổn định, năng
suất cao, sử dụng lao động tối thiểu và có chứa hàm lượng tinh bột khá cao, thích
hợp với khí hậu nhiệt đới ẩm...[2]. Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng
nhiệt đới, cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực có sản lượng đứng thứ
hai sau lúa. Trong các cây lấy củ, sắn có diện tích thấp hơn ngô nhưng năng suất và
sản lượng thì cao hơn hẳn [24]. Hơn nữa, hiện nay nhà nước ta đang có những chính
sách khuyến khích người nông dân trồng sắn và nhờ việc áp dụng các giống sắn mới
có năng suất cao và hàm lượng tinh bột lớn nên sản lượng và năng suất sắn ngày
càng tăng cao, diện tích trồng sắn cũng ngày càng được mở rộng (Hình 1.2). Hiện
tại, sản lượng sắn của Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới, đứng thứ năm ở châu
Á.

Hình 1.2 Diện tích và sản lượng sắn cả nước

11


bào thành dày, ngoài xenluloza là chính còn chứa 5 – 8% tinh bột. Trong vỏ cùi có
các sắn tố, độc tố, enzim…
 Thịt sắn, là thành phần chủ yếu của củ sắn, bao gồm các tế bào nhu mô thành
mỏng. Thành phần vỏ tế bào nhu mô là xenluloza, pentozan, bên trong là các hạt
tinh bột và nguyên sinh chất. Lượng tinh bột trong thịt sắn phân bố không đều,
nhiều nhất ở lớp ngoài rồi giảm dần vào bên trong.
 Ngoài các tế bào nhu mô còn có các tế bào thành cứng không chứa tinh bột,
cấu tạo từ xenluloza nên cứng như gỗ. Loại tế bào này có nhiều ở đầu cuống và ở
các củ sắn lưu niên.
Thành phần chủ yếu của sắn là tinh bột (65 – 70%), protein (1,75%), chất
béo (0,9%), xenluloza (3,4%), chất tro (1,8%). Độ ẩm của sắn thường trong khoảng
14% [6]. Hạt tinh bột sắn có kích thước từ 5 đến 40 µm với những hạt lớn 25-35
µm, hạt nhỏ 5-15 µm và nhiều hình dạng. Hạt tinh bột có cấu trúc dạng xốp, liên kết
giữa các phần tử trong cấu trúc phân tử yếu nên nó dễ bị phân hủy bởi các tác nhân
như axit và enzim hơn so với các hạt tinh bột khác như ngô và gạo [5].
Tinh bột sắn có hai thành phần cấu tạo: amiloza chiếm 18 - 22%, amilopectin
chiếm 78 - 80%. Nhiệt độ bắt đầu hồ hoá của tinh bột sắn là 58oC, nhiệt độ hồ hoá
là 65oC và nhiệt độ hồ hoá hoàn toàn là 68oC. Tinh bột sắn có màu trắng sáng, óng
ánh khi nhìn dưới nắng. Tinh bột bị hồ hoá biến thành màu nâu trong hơi ngả về

13


xám. Tinh bột sắn không có mùi đặc trưng, khi hồ hoá dậy mùi đặc trưng dễ phân
biệt với các loại tinh bột khác. Khi hồ hoá, độ nhớt tăng rất nhanh, độ dính rất cao
so với tinh bột khoai và các loại củ khác [1].

1.3 SẢN XUẤT CỒN TỪ NGUYÊN LIỆU GIÀU TINH BỘT
1.3.1 Sản xuất cồn theo công nghệ truyền thống [6]
Công nghệ sản xuất cồn theo phương pháp truyền thống được thể hiện tóm

đường được gọi là quá trình đường hoá. Quá trình này đóng vai trò vô cùng quan
trọng trong công nghệ sản xuất cồn. Nó quyết định đến phần lớn hiệu suất thu hồi
cồn.
Muốn đạt hiệu quả cao trong quá trình thuỷ phân tinh bột thì vấn đề quan trọng
trước tiên là chọn tác nhân đường hoá. Trước kia người ta thường sử dụng axit HCl
hoặc axit H2SO4 để thuỷ phân tinh bột, nhưng hiện nay rất ít dùng vì giá thành cao
mà hiệu suất thu hồi cồn lại thấp. Ở một số nước trên thế giới vẫn còn sử dụng
amylaza của thóc mầm (malt đại mạch) để thuỷ phân tinh bột trong sản xuất cồn
nhưng phần lớn hiện nay các nước đều dùng amylaza có nguồn gốc vi sinh vật. Tiêu
biểu là hai chế phẩm enzim dịch hóa Termamyl SC và enzim đường hóa
Dextrozyme GA của hãng Novo Đan Mạch.
Termamyl SC là chế phẩm amylaza dạng lỏng chịu được nhiệt độ cao được
sản xuất từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis. Termamyl SC là một endo-

15


amylaza có tác dụng thủy phân liên kết α-1,4 glucozit của amyloza và amylopectin.
Tinh bột dưới tác dụng của Termamyl SC nhanh chóng tạo thành dextrin và
oligosaccarit tan trong nước, làm giảm độ nhớt của dịch bột đã được hồ hóa. Chế
phẩm Termamyl dễ hòa tan trong nước ở một nồng độ nhất định trong điều kiện
thường. Điều kiện tối ưu cho enzim Termamyl SC hoạt động là vùng pH = 5 - 7 và
nhiệt độ tối ưu là 90 - 95oC.
Dextrozyme GA là một enzim glucoamylaza được thu nhận từ chủng
Aspergillus đã được biến đổi gen. Dextrozyme GA có dạng lỏng màu nâu, tỷ trọng
1,15 g/ml. Dextrozyme GA có tác dụng thủy phân các nối liên kết α-1,4 và 1,6-D
glucozit của tinh bột đã được dịch hóa. Trong quá trình thủy phân enzim tách từng
đơn vị glucoza từ đầu không khử của mạch tinh bột. Điều kiện tối ưu cho enzim
hoạt động là nhiệt độ 60 - 62oC và pH = 4,1 - 4,3.
1.3.1.4 Quá trình lên men