ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THANH DUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VI RÚT HIBV, HBCV, HCIV Ở NGƢỜI
HIẾN MÁU TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG
NĂM 2013 - 2014

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THANH DUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VI RÚT HIBV, HBCV, HCIV Ở NGƢỜI
HIẾN MÁU TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG
NĂM 2013 - 2014

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 06420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

trƣờng Trƣờng đại học Khoa học tự Tự nhiên - ĐHQGHN, ngƣời thầy đã động
viên, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ với tôi những kiến thức vô cùng quý
báu trong suốt quá trình tôi tham gia khóa học và hoàn thành luận văn này.


Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp trong Khoa Xét
nghiệmnghiêm sàng lọc máu, Khoa Hiến máu và các thành phần máu, Khoa Tổ
chức vận động hiến máu, Phòng Công nghệ thông tin, Khoa Vi sinh Viện Huyết học
– Truyền máu Trung ƣơng đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời hiến máu đã cho tôi số liệu quý giá
trong nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ và
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác.
Cuối cùng tôi xin đƣợc tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới Bố, Mẹ, Chồng,
hai Con, và các anh chị em trong gia đình đã quan tâm, động viên, khích lệ để tôi
không ngừng học tập và phấn đấu.
Tôi xin chân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 08 năm 2015
Nguyễn Thị Thanh Dung


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
nghiên cứu trong luận văn này là có thật, do tôi thu thập và thực hiện tại Viện
Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng. Kết quả nghiên cứu của luận văn này
chƣa đƣợc đăng tải trên bất kỳ một tạp chí hay công trình nghiên cứu khoa
học nào.


...................................................................................................... 352829
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 373032
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .................................................... 373032
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................ 373032
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm ................................................................... 373032
2.2.2. Hóa chất xét nghiệm ............................................................ 383032


2.2.3. Trang thiết bị sử dụng trong xét nghiệm .............................. 383133
2.2.4. Dụng cụ sử dụng trong xét nghiệm ...................................... 393134
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 393134
2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................... 393134
2.3.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ............................... 393234
2.3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................... 423437
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU ........................................................................ 443639
2.5. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ........................... 443639
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............... 463640
3.1. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV, KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH ở NHM TạI VIệN
HUYếT HọC – TRUYềN MÁU TRUNG ƢƠNG NĂM 2013-2014.................. 463640
3.2. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV, KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH ở NGƢờI HIếN MÁU
LầN ĐầU VÀ NHắC LạI TạI VIệN HUYếT HọC - TRUYềN MÁU TW NĂM 2013-2014
......................................................................................................... 574751
3.3. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV, KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH ở NGƢờI HIếN MÁU
LầN ĐầU THEO GIớI TÍNH TạI VIệN HUYếT HọC – TRUYềN MÁU TW NĂM 20132014.................................................................................................. 605054
3.4. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV, KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH ở NGƢờI HIếN MÁU
LầN ĐầU LIÊN QUAN ĐếN NGHề NGHIệP CủA NHM ................................. 635357
3.5. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV, KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH ở NGƢờI HIếN MÁU
LầN ĐầU LIÊN QUAN ĐếN TUổI CủA NHM .............................................. 685862
3.6. Tỷ Lệ HBSAG, KT-HCV VÀ KN-KT HIV DƢƠNG TÍNH THEO SINH PHẩM XÉT
NGHIệM .............................................................................................. 726266

Bảng 3.5. So sánh tỷ lệ KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM với các tác giả khác
................................................................................................................. 415
Bảng 3.6. Tỷ lệ HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM tình
nguyện...................................................................................................... 426
Bảng 3.7. Tỷ lệ HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM chuyên
nghiệp ...................................................................................................... 448
Bảng 3.8. Tỷ lệ HBsAg dƣơng tính ở NHM lần đầu và nhắc lại ............. 4751
Bảng 3.9. Tỷ lệ KT-HCV dƣơng tính ở NHM lần đầu và nhắc lại .......... 4852
Bảng 3.10. Tỷ lệ KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM lần đầu và nhắc lại ... 4953
Bảng 3.11. Tỷ lệ HBsAg dƣơng tính ở NHM lần đầu theo giới tính ......... 504

Formatted: English (United States)

Bảng 3.12. Tỷ lệ KT-HCV dƣơng tính ở NHM lần đầu theo giới tính ...... 515

Formatted: English (United States)

i


Bảng 3.13. Tỷ lệ KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM lần đầu theo giới tính . 526

Formatted: English (United States)

Bảng 3.14. Tỷ lệ HBsAg dƣơng tính ở NHM lần đầu liên quan đến nghề
nghiệp của NHM ...................................................................................... 548
Bảng 3.15. Tỷ lệ KT-HCV dƣơng tính ở NHM lần đầu liên quan đến nghề
nghiệp của NHM ...................................................................................... 559

Formatted: English (United States)


Bảng 3.22. Tỷ lệ KN-KT HIV dƣơng tính theo sinh phẩm xét nghiệm đang sử
dụng ......................................................................................................... 648

Formatted: English (United States)

Bảng 3.23. Tỷ lệ HBV-DNA dƣơng tính trong các đơn vị máu tiếp nhận tại
Viện HH-TMTW từ 19/12/2014 đến 31/06/2015 ..................................... 659

Formatted: English (United States)

Bảng 3.24. So sánh tỷ lệ HBV-DNA dƣơng tính ở NHM đã đƣợc sàng lọc
HBsAg âm tính với các tác giả khác ....................................................... 6670

Formatted: English (United States)

Bảng 3.25. Số lần hiến máu của NHM có HBV-DNA dƣơng tính .......... 6772

Formatted: English (United States)

Bảng 3.26. Độ tuổi của NHM có HBV-DNA dƣơng tính ....................... 6872
Bảng 3.27. Đặc điểm về đối tƣợng NHM có HBV-DNA dƣơng tính ...... 6973
ii

Formatted: English (United States)


Bảng 3.28. Đặc điểm về nghề nghiệp của NHM có HBV-DNA dƣơng tính
........................................................................................................ .......6974


Hình 1.3. Cấu trúc HCV ............................................................................ 9
Hình 1.4. Cấu trúc genome HCV ............................................................... 9
Hình 1.5. Chuyển đổi huyết thanh học ngƣời nhiễm HCV ....................... 11
Hình 1.6. a) Cấu trúc HBV dƣới kính hiển vị điện tử thể hiện thể Dane có khả
năng truyền nhiễm, các dƣới hạt hình cầu (Sphere – 22 µm) và dạng sợi
(Filament). b) Cấu trúc của HBV ............................................................. 13
Hình 1.7. Cấu trúc của HBV (thể Dane) và các dƣới hạt ....................... 134
Hình 1.8. Chuyển đổi huyết thanh học ngƣời nhiễm HBV ....................... 15
Hình 1.9. Chất đánh dấu gắn ở kháng thể/kháng nguyên cho phép phát hiện
phức hợp kháng nguyên – kháng thể ................................................... 1820
Hình 1.10. Diễn biến huyết thanh học của HIV và khoảng thời gian phát hiện
của các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện HIV ........................................... 223
Hình 2.12. Đƣờng cong khuếch đại sản phẩm sau real time PCR .......... 337

Formatted: Normal, Left, Space Before: 6 pt,
After: 6 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li, Tab
stops: 15 cm, Right,Leader: …

iv


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ - SƠ ĐỒHÌNH

Sơ đồHình 2.21. Sơ đồ nghiên cứu theo mục tiêu ........................................... 358
Biểu đồHình 3.1. So sánh tỷ lệ HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV ở ngƣời hiến máu
tình nguyện và ngƣời hiến máu chuyên nghiệp ............................................ 459
Biểu đồHình 3.2. Đặc điểm về giới của ngƣời hiến máu có cosHBV-DNA dƣơng
tính … ................................................................................................... 6771
Formatted: Left



4

Anti HBe

5

Anti HBs

6

Au

7

CLIA

8

bDNA

9

cDNA

10

DNA

11

(Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme)
Food and Drug Administration
13

FDA

14

gp

15

HBcAg

16

HBeAg

17

HBsAg

18

HBV

19

HCV



23

KN

Kháng nguyên

24

KT

Kháng thể

25

LCR

26

MGP

27

NASBA

Ligase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi Ligase)
Magetic Glass Particles (Hạt thủy tinh từ tính)
Nucleic acid sequence based amplification
(Kỹ thuật khuếch đại chuỗi axit nucleic)

TMA

(Xét nghiệm phát hiện axit nucleic)
Ngƣời hiến máu
Particular Agglutination
(Kỹ thuật ngƣng kết hạt)
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi)
Acid Ribonucleic (ARN)
Reverse Transcriptase (Enzym phiên mã ngƣợc)
Transcription Mediated amplification method

Viện
35

(Khuếch đại qua trung gian phiên mã)
Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng

HH-TMTW
36

XN

37

WHO

Xét nghiệm
World Health Organization


1


giới đã bổ sung thêm kỹ thuật NAT dể phát hiện HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA
nhằm rút ngắn thêm nữa giai đoạn cửa sổ của nhiễm các virus này [52], [59], [60],
[70].
Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã đƣợc triển khai tại một số nƣớc phát triển (Mỹ,
Đức, Nhật..) để hạn chế tối đa việc lây truyền HIV, HBV, HCV cho ngƣời bệnh trong
giai đoạn cửa sổ: Cụ thể, với kỹ thuật NAT để phát hiện HCV-RNA đã giúp giảm thời
gian cửa sổ từ 90 ngày xuống còn từ 30 đến 40 ngày sau khi nhiễm HCV; với việc phát
hiện HIV-RNA đã giảm thời gian cửa sổ từ từ 20 ngày xuống còn 11 ngày; với việc
phát hiện HBV-DNA đã giảm thời gian cửa sổ từ 60 ngày xuống còn 20 đến 30 ngày
đối với HBV [60], [61], [71], [72].
Tại Việt Nam, sàng lọc huyết thanh học đối với HIV, HBV ở ngƣời hiến máu đã
đƣợc thực hiện từ cuối năm 1994, sàng lọc HCV đƣợc tiến hành vào năm 1999 trên
phạm trên phạm vi toàn quốc. Năm 2013 Bộ Y tế đã ban hành thông tƣ “Hƣớng dẫn
hoạt động truyền máu” – Thông tƣ 26/2013/TT-BYT ngày 16/9/2013 thì xét nghiệm
NAT bắt buộc phải tiến hành thƣờng quy để sàng lọc các đơn vị máu tại các trung tâm
truyền máu theo lộ trình quy định [4], [5]. Năm 2015 Viện Huyết học – Truyền máu
Trung ƣơng (Viện HHTMTW) đã bắt đầu triển khai kỹ thuật NAT để bổ sung cho kỹ
thuật ELISA sàng lọc HIV, HBV, HCV cho ngƣời hiến máu. Do vậy việc đánh giá các
kết quả sàng lọc HBV, HCV, HIV cho ngƣời hiến máu tại Viện HHTMTW giai đoạn
2013-2015 là rất cần thiết, chính vì vậy chúng tôi em tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu sàng lọc vi rút HIBV, HBCV, HCIV ở ngƣời hiến máu tại Viện Huyết
học – Truyền máu Trung ƣơng năm 2013 – 2014” với hai mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu, kết quả sàng lọc đƣợc HBV, HCV, HIV bằng phƣơng pháp huyết
thanh học tại Viện Huyết học – Truyền máu TW năm 2013-2014.

2


[51], [69], [71].
Năm 1984, ngƣời ta cũng đã xác định đƣợc tế bào CD4 là 1 tế bào đích của HIV.
Năm 1996, đã phát hiện ra các đồng thụ thể CCR5, CXCR4, các thụ thể này có mặt ở
trên các đại thực bào và tế bào lympho có liên quan đến sự xâm nhập của virus vào
trong cơ thể. Một số enzyme quan trọng của virus cũng lần lƣợt đƣợc phát hiện nhƣ:
intergrase (năm 1992), protease và một số yếu tố có vai trò trong sự trƣởng thành của
virus, cũng nhờ những hiểu biết này mà các phƣơng pháp điều trị HIV đã và đang đƣợc
áp dụng một cách rộng rãi cho những bệnh nhân HIV/ AIDS [51].

4

Formatted: Centered


1.1.1.2. Cấu trúc virus HIV
HIV thuộc họ nhóm Retroviridae, nhóm thuộc họ Lentivirus. Cấu trúc của hạt
virus hoàn chỉnh (virion) gồm 3 lớp:
- - Lớp vỏ ngoài (vỏ envelop);:

Formatted: Indent: First line: 1.27 cm

- Lớp này là một màng kép có kháng nguyên chéo với màng sinh chất
của tế bào. Gắn lên màng này là các phân tử glycoprotein có trọng lƣợng phân tử là
160 (gp160), 120 (gp120), 41 (gp41) kilodalton [10], [51], [59].
- Lớp vỏ trong (vỏ capsit);
- Genom virus bao gồm 2 phân tử ARN (+) giống nhau bắt cặp vơi phân tử
tARN của tế bào nhờ cầu nối hydro. Mỗi sợi dài 8,5 - 9,5 kb. Sau khi phiên mã đƣợc
gắn mũ đầu 5’ và đầu 3’ đƣợc gắn đuôi poly A, đặc : Vỏ này gồm 2 lớp protein gồm
lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein p18 (với HIV-2) và p17 (với HIV-1) và lớp
trong hình trụ không đều có cấu tạo từ các phân tử protein p24 [10], [51], [59].


Các
genProtein
cấu trúc
Pol

Gen Pol mã cho enzyme dùng trong phiên mã ngƣợc. Sản
phẩm của gen pol có hoạt tính enzyme khác nhau:
polymeraza, ribonucleaza và endonucleaza. Endonucleaza
có hoạt tính integraza hoặc lygaza để gắn xen AND vào
nhiễm sắc thể của tế bào.Các enzyme cc thể của Protease:
Tách các protein đƣợc mã hóa bởi gen Gag và Pol thành các
phân tử hoạt động.

RT: Là enzyme DNA polymerase phụ thuộc RNA,
dạng hoạt động của nó là p66/51 ở HIV-1 và p68 ở HIV-2,
đảm nhiệm sao mã bộ gien virus thành DNA trung gian.

Intergrase: Làm nhiệm vụ gắn liên kết DNA của
virus vào DNA của tế bào vật chủ

Protein Các
gen
điều Tat
hòa phiên
mã
Rev

Làm tăng sự phiên mã của virusMã cho protein p16 điều
hòa sự kéo dài phiên mã. Thiếu protein này sự phiên mã sẽ

tố biểu hiện âm tính, đó là protein làm giảm biểu hiện của
gen.

Vif

Nhân tố lây nhiễm làm tăng sự trƣởng thành (chín) và giải
phóng HIV ra ngoài tế bào.Mã cho protein p23 là yếu tố gây
nhiễm, làm tăng khả năng nẩy chồi giúp cho virus dễ dàng
xâm nhập từ tế bào này sang tế bào khác. Nếu thiếu gen vif
virus sẽ mất khả năng gây nhiễm.

Vpu

Mã cho protein có vai trò lLàm tăng sự chín và giải phóng
HIV ra ngoài tế bào bằng cách điều chỉnh cân bằng kênh ion
K+ ở màng tế bào, làm thoái hóa CD4, ức chế hoạt hóa NFκB.

Vpr

Mã cho các prtotein liên quan đến cCác liên kết của virus,
tải nạp qua màng, biệt hóa, chu kỳ tế bào, điều hòa …

1.1.1.3. Chuyển đổi huyết thanh của ngƣời nhiễm HIV/AIDS
Khi xâm nhập vào cơ thể, HIV tồn tại trong các hạch bạch huyết của ngƣời bị
nhiễm. Một ngƣời đã bị nhiễm HIV thì DNA-HIV đƣợc phát hiện trong các bạch cầu
từ ngày thứ 17 đến 20 và kháng thể HIV có thể đƣợc phát hiện từ ngày thứ 20 đến 25
[50]. có thể phát hiện đƣợc RNA-HIV trong huyết tƣơng vào ngày thứ 14 đến 15.
Diễn biến huyết thanh học của nhiễm HIV có thể đƣợc chia thành bốn giai đoạn
chính nhƣ sau:


- Giai đoạn II: Là giai đoạn nhiễm tiềm tàng, thƣờng không có biểu hiện bệnh,
nhƣng trong cơ thể virus vẫn nhân lên. Giai đoạn này thƣờng kéo dài nhiều năm, ƣớc
tính trung bình từ 9 đến 10 năm hoặc lâu hơn. Trong huyết thanh bệnh nhân, ngƣời

8


hiến máu xuất hiện kháng thể chống HIV loại IgM, tiếp đó là sự hình thành KT chống
HIV loại IgG [68], [69].
- Giai đoạn III: Là giai đoạn xuất hiện các biểu hiện lâm sàng của bệnh AIDS rõ
ràng, biểu hiện đầu tiên là số lƣợng tế bào CD4 giảm xuống dƣới 500 tế bào/µl, số đếm
bản sao virus vƣợt ngƣỡng 10.000/ml. Biểu hiện lâm sàng đặc trƣng ở giai đoạn này là
nhiễm nấm hầu họng và nấm candida âm đạo đối với nữ, nhiễm vi khuẩn Herpes zoster
gây bệnh zona thần kinh ngoại biên [59].
- Giai đoạn IV: Là giai đoạn muộn của bệnh AIDS, ở giai đoạn này bệnh nhân
xuất hiện nhiều biến chứng thứ phát do hệ miễn dịch bị suy giảm mạnh mẽ, số lƣợng tế
bào CD4 chỉ còn dƣới 200 tế bào/µl. Một số bệnh nhiễm trùng cơ hội có thể gặp ở
bệnh nhân AIDS nhƣ: tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm nấm [59].
1.1.1.4. Đƣờng lây truyền virus HIV
HIV lây truyền qua 3 đƣờng chính: (1) Quan hệ tình dục với ngƣời bị nhiễm
HIV, (2) tiếp xúc trực tiếp với máu và các sản phẩm máu, các mô bị nhiễm HIV và (3)
truyền từ mẹ sang con. Trên toàn cầu, ngƣời ta ƣớc tính có tới từ 70% đến 80% ngƣời
nhiễm HIV qua con đƣờng tình dục, HIV truyền do tiếp xúc trực tiếp với máu và các
chế phẩm từ máu nhƣ: máu toàn phần, huyết tƣơng, và các yếu tố đông máu. Các sản
phẩm khác của máu nhƣ: globulin miễn dịch, albumin, huyết tƣơng... Các nguy cơ lây
truyền khác: từ bệnh nhân bị nhiễm HIV sang nhân viên chăm sóc y tế, thụ tinh nhân
tạo, cấy ghép nội tạng [59].
1.1.2. Virus viêm gan C
1.1.2.1. Lịch sử phát hiện
Trong những năm 1970, khi các xét nghiệm các mẫu máu để phát hiện virus