ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Đặng Thị Kim Anh
CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Đặng Thị Kim Anh
CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Đặng Thị Kim Anh
K21-Sinh học thực nghiệm
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ............................................................................... 3
1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ......................................................... 4
1.2.1. Phân loại enzyme phytase .......................................................................... 4
1.2.2. Nguồn phytase........................................................................................... 6
1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE ................................................................................... 7
1.3.1. Trong chăn nuôi ......................................................................................... 7
1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm ...................................................................... 8
1.3.3. Trong công nghiệp giấy ............................................................................. 8
1.3.4. Trong cải tạo đất........................................................................................ 9
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate .............................. 9
1.4. CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÕNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI.................... 10
1.5. CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM........................................ 11
1.6. CấU TRÖC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A. NIGER
VÀ A. FUMIGATUS .................................................................................................... 13
CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18
2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................. 18
2.1.1. Hóa chất ................................................................................................... 18
3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm ............................. 34
3.2. CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORIS ....... 38
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp
xung điện ................................................................................................................ 38
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris ........... 40
3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp ................................... 41
3.3. THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP ................. 42
3.4. XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP SAU
KHI CẢI BIẾN GEN .............................................................................................. 44
3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp .............................................. 44
3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp .......................... 45
3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp ...................................... 46
3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao ............................................................................................................ 47
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 50
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 52
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 60
K21-Sinh học thực nghiệm
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOX1
Alcohol Oxidase 1
Đơn vị hoạt tính phytase
HIV
Human Immunodeficiency Virus
IU
International Unit
kb
Kilobase
kDa
Kilo Dalton
LB
Luria-Bertani medium
Northern Regional Research Laboratory
NRRL
(hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)
(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)
OD
TCA
Trichloroacetic acid
TEMED
Tetramethylethylenediamine
YPD
Yeast Extract-Peptone-Dextrose
YPDS
Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol
K21-Sinh học thực nghiệm
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 19
Bảng 2.2. Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa
phyA ......................................................................................................................... 20
Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein ....................................................... 27
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm........................ 28
Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi
đĩa 24 giếng .............................................................................................................. 41
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và
vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 .... 37
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 39
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5
vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện ................................ 39
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyAStop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 ........................................ 40
Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% ............. 43
Hình 3.12. Xác định pH tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin ....
.................................................................................................................................. 45
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin
.................................................................................................................................. 46
K21-Sinh học thực nghiệm
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 47
Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 48
K21-Sinh học thực nghiệm
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của
phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu
trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Phytase
của A. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả
năng hồi tính. Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn
hồi” nhiệt của enzyme.
Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt
Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase,
đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên
K21-Sinh học thực nghiệm
1
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
cứu. Trong số đó, phytase từ A. niger đƣợc tách dòng và biểu hiện trên Pichia
pastoris. Giống nhƣ các phytase tự nhiên khác từ A. niger, enzyme thu nhận đƣợc
chƣa đảm bảo đƣợc tính bền nhiệt nhƣ mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài nghiên cứu: “Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc
Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao” nhằm cải thiện đặc tính công nghệ của enzyme tái tổ hợp. Để đạt
đƣợc mục tiêu trên, gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger đƣợc biến đổi bằng
Mega-PCR tạo 4 axit amin mới thay thế cho 4 axit amin trong cấu trúc protein nhằm
tăng độ bền vững đồng thời duy trì các đặc tính cơ bản về hoạt tính và pH hoạt động
của enzyme.
K21-Sinh học thực nghiệm
của thực vật.
K21-Sinh học thực nghiệm
3
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
Với động vật, axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh nhờ khả
năng liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại nhƣ Ca2+,
Mg2+, Zn2+. Những liên kết này tạo phức hợp không hòa tan trong đƣờng tiêu hóa,
dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [17, 47]. Trong số các kim
loại, kẽm là nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hƣởng lớn nhất
bởi axit phytic. Axit phytic bổ sung vào thức ăn có thể làm giảm mạnh khả năng
hấp thụ ion Zn2+ và giảm trọng lƣợng của chuột [48]. Axit phytic còn tƣơng tác với
protein trong dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein. Liên kết giữa
protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của
protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dƣỡng của chúng. Hơn nữa, ngoài liên kết
với muối khoáng, protein, axit phytic còn tƣơng tác với các enzyme tiêu hoá nhƣ
trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những
enzyme này [20, 32, 55].
1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase)
Phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc
tác phản ứng thủy phân myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (phytate) thành
những gốc phosphate đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol
phosphate. Ở một số loài nấm, phytase có thể giải phóng myo-inositol tự do.
1.2.1. Phân loại enzyme phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme
(BPPhy), Protein tyrosine phytase (PTPhy), Purple Phosphatase Acid (PAPhy) và
Histidine Acid Phosphatase (HAPhy) [67].
Theo tính năng và cấu trúc, ngƣời ta còn chia phytase ra 4 nhóm nhƣ sau: (1) βPropellar Phytase (BPPhy): hoạt động ở pH kiềm và cần ion Ca2+ cho khả năng xúc
tác và bền nhiệt, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3); (2) Protein
tyrosine phytase (PTPhy): hoạt động ở pH axit, chứa nhóm xúc tác cysteine, sản
phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate; (3) Purple Phosphatase Acid
(PAPhy): chứa axit amin có gắn kim loại Fe2+ và Fe3+, Zn2+, Mg2+ hoặc Mn2+ ở
trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của enzyme này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ; (4)
Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): hoạt động ở pH thấp, chứa trình tự axit amin
bảo thủ: RH[GN]xRx[PAS] ở đầu N và HD ở đầu C (Hình 1.2). Các nhóm này khác
nhau về cấu trúc phân và cơ chế xúc tác cho phép chúng sử dụng axit phytic làm
K21-Sinh học thực nghiệm
5
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
nguồn cơ chất trong các môi trƣờng khác nhau. Trong đó, phytase của Aspergillus
niger
và Aspergillus fumigatus thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase đƣợc
nghiên cứu rộng rãi nhất.
1.2.2. Nguồn phytase
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ vi sinh vật, thực
vật và động vật.
Phytase từ vi sinh vật
Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở nấm mốc, đặc biệt ở các
tƣơi [43]. Đặc biệt, một số loại hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch ...) có hoạt tính
phytase cao và có thể đạt trên 5000 IU kg-1.
Phytase từ động vật
Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động
vật dạ dày đơn [13]. Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn
không có vai trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate có trong thức ăn [66].
Một enzyme giống nhƣ phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong động vật nguyên
sinh Paramecium [24]. Cá vƣợc sọc lai có chứa phytase hoạt động ở pH tối ƣu 3,54,5 [21].
1.3. Ứng dụng của phytase
1.3.1. Trong chăn nuôi
Động vật nhai lại tiêu hóa đƣợc muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật
sống trong dạ cỏ tiết ra. Phospho vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ đƣợc khu hệ vi
sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn
nhƣ lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa phytate vì chúng không có hoặc
có rất ít phytase trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phospho cho cơ
thể vật nuôi, ngƣời ta đã bổ sung phospho vô cơ vào thức ăn. Điều này sẽ làm tăng
chi phí thức ăn và gây ra ô nhiễm phospho, đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy
sản. Ô nhiễm phospho xuất phát từ lƣợng dƣ thừa trong thức ăn hòa tan vào môi
trƣờng nƣớc, cộng với muối phytate không đƣợc tiêu hoá thải qua phân và đƣợc vi
sinh vật sống trong đất phân giải thành phospho vô cơ. Khi chất này dƣ thừa tạo
điều kiện thuận lợi cho các loài tảo sinh trƣởng, phát triển. Tảo phát triển quá mức
sẽ gây hiện tƣợng "nƣớc nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nƣớc
khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [2]. Khi bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng hấp thu phospho ngay trong
chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lƣợng chất này thải qua phân [4].
Nhiều nghiên cứu chứng minh phytase giúp giải phóng phospho khó tiêu trong
đƣờng tiêu hóa của động vật; tăng cƣờng khả năng hấp thu khoáng nhƣ Zn2+, Mg2+,
Fe2+ cải thiện khả năng tiêu hóa protein. Bổ sung phytase vào thức ăn cho gia cầm
K21-Sinh học thực nghiệm
Việc loại bỏ axit phytic rất quan trọng trong ngành công nghiệp giấy. Trƣớc
khi ứng dụng enzyme phytase, việc loại bỏ thành phần axit phytic đƣợc tiến hành
bằng con đƣờng hóa học. Phƣơng pháp này có mặt trái tạo ra những chất có khả
năng gây ung thƣ và những chất thải có độ độc cao. Trong khi đó ứng dụng công
nghệ enzyme để loại bỏ axit phytic trong thực vật sẽ giúp cải thiện môi trƣờng cũng
K21-Sinh học thực nghiệm
8
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
nhƣ góp phần vào sự phát triển của công nghệ sạch [37]. Những phytase bền ở nhiệt
độ cao thƣờng đƣợc sử dụng để phân giải axit phytic trong quá trình chế biến giấy.
1.3.4. Trong cải tạo đất
Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lƣợng
phospho hữu cơ trong đất [16]. Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho
thấy khả năng sinh trƣởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi
bổ sung phytase vào đất trồng [22]. Nghiên cứu này cũng mở ra một hƣớng trong
tƣơng lai có thể chuyển và biểu hiện gen phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng
giá trị phospho dễ tan trong đất.
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate
Một số myo-inositol phosphate có ứng dụng quan trọng trong dƣợc học.
Inositol phosphate và phospholipid có vai trò nòng cốt trong việc truyền tín hiệu
qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào [11]. Một số inositol
triphosphate đƣợc sử dụng để phòng tránh viêm khớp, bệnh hen, hoặc làm thuốc
giảm đau [56]. Este của inositol triphosphate đƣợc sử dụng làm chất ức chế chống
lại sự lây nhiễm các bệnh do nhóm retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [57]. Tuy
nhiên, việc tổng hợp bằng con đƣờng hoá học các myo-inositol phosphate này gặp
Luận văn thạc sĩ
1.4. Các nghiên cứu tách dòng biểu hiện phytase trên thế giới
Từ những năm 1990, Laboure và CS đã tinh sạch, mô tả đặc điểm của phytase
từ hạt ngô đang nảy mầm và gen mã hóa cũng đã đƣợc tách dòng từ cDNA [35].
Phytase có lợi cho tiêu hóa do khả năng phân giải Fe-phytate, Zn-phytate, tuy nhiên,
phytase của lúa mỳ bị mất tác dụng khi đun nấu ở nhiệt độ cao. Nhóm nghiên cứu
của Viện Khoa học Nông nghiệp Đan Mạch đã nhân giống thành công lúa mỳ biến
đổi gen khi chuyển gen phytase chịu nhiệt từ A. fumigatus. Phytase của chủng lúa
mỳ biến đổi gen bền nhiệt hơn và có hàm lƣợng tăng gấp 6 lần so với giống chƣa
biến đổi gen. Một số nghiên cứu tƣơng tự cũng đƣợc tiến hành trên lúa với nguồn
gen phytase của vi khuẩn [42], hoặc trong khoai tây với gen phyA từ nấm [61].
Craxton và CS (1997) đã tách dòng và biểu hiện một inositol polyphosphatase
phức tạp từ gan chuột (MIPP) có hoạt tính phytase. RNA thông tin của MIPP có
mặt trong tất cả các mô của chuột, nhƣng nó chỉ biểu hiện rõ nhất ở gan và thận
[15]. Chuột mang gen appA của E. coli biểu hiện phytase trong tuyến nƣớc bọt giúp
giảm lƣợng phytate trong phân từ 8,5-12,5% [71]. Lợn chuyển gen mang gen appA
của E. coli có khả năng tiết nƣớc bọt chứa phytase giúp giảm đến 60% lƣợng
phospho thải qua phân [23].
Vi sinh vật là đối tƣợng đƣợc sử dụng rộng rãi để biểu hiện phytase, với nhiều
nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa phytase trên các đối tƣợng vi sinh vật
khác nhau. Năm 2004, Xiong và CS đã chuyển gen có kích thƣớc 1347 bp của A
niger SK-57 vào P. pastoris và thu đƣợc 6,1 g protein tinh khiết trên 1 lít môi
trƣờng nuôi cấy, với hoạt tính 865 IU ml-1. Do quá trình glycosyl hoá nên phytase
tái tổ hợp thu đƣợc có kích thƣớc khác nhau (64, 67, 87, 110 và 120 kDa). Những
phân tích hóa sinh cho thấy enzyme này hoạt động tối thích ở pH 2,5 và 5,5, nhiệt
độ 60C [68]. Gen appA mã hóa enzyme phytase tách dòng từ Yersinia kristeensenii
đƣợc biểu hiện trên P. pastoris. Enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ƣu đạt 2656 U mg-1
ở nhiệt độ 55 °C trong điều kiện pH thấp khoảng 4,5. Hoạt tính của nó duy trì tốt
griseoroseum PG63. Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cao hơn hẳn so với chủng gốc,
có pH tối ƣu là 5,0, duy trì hoạt tính trong dải pH 3,0 – 8,0 và nhiệt độ 70 – 80 °C
[14]. Phytase từ vi sinh vật có sự đa dạng cao nhất về khả năng công nghệ. Phytase
từ A. aculeatus có khả năng bền nhiệt [74], phytase từ A. fumigatus có khả năng bền
với pepsin [70], phytase từ Yersinia kristeensenii hoạt động tốt trong dải pH rộng
1,5 – 11,0 [18].
1.5. Các nghiên cứu về enzyme phytase ở Việt Nam
Với hiệu quả kinh tế rõ rệt trong chăn nuôi, phytase hiện đang đƣợc sử dụng
rộng rãi ở Việt Nam. Hầu hết các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi công nghiệp
đều sử dụng phytase trong thành phần dinh dƣỡng bổ sung cho vật nuôi. Nguồn
K21-Sinh học thực nghiệm
11
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
phytase đƣợc nhập chủ yếu từ Châu Âu và Trung Quốc. Trong số các enzyme,
phytase đƣợc nhập khẩu với lƣợng lớn nhất kể cả về giá trị và khối lƣợng. Chính vì
vậy, những nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập
khẩu đang đƣợc nhiều nhà khoa học trong nƣớc quan tâm. Nguyễn Thùy Châu từ
2007 - 2009 đã nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytase bằng hình
thức lên men bề mặt. Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng các chủng A. niger ATCC
9142 và A. ficcum NRRL 3135 từ bộ sƣu tập giống của Mỹ, A. niger NCIM,
Rhizopus microsporus từ Cộng hòa Séc và chủng A. niger DL1 phân lập từ Việt
Nam. Nhóm tác giả đã nghiên cứu qui trình lên men rắn sản xuất phytase ở qui mô
pilot. Theo đó, chủng sản xuất đƣợc lên men ở nhiệt độ 30C trong 7 ngày trên môi
trƣờng P3. Cơ chất sau lên men đƣợc tách chiết enzyme bằng dịch oxy già 5%,
enzyme thô đƣợc thu bằng ly tâm và tủa bằng cồn 96, sấy khô tạo chế phẩm VS1.
triển, hoàn thiện tiến tới sản xuất phytase trong nƣớc.
1.6. Cấu trúc protein liên quan đến khả năng hồi tính của phytase từ A. niger
và A. fumigatus
Phytase ứng dụng trong chăn nuôi cần đảm bảo các yêu cầu nhƣ tính bền nhiệt
để xử lý ở 70 - 80 C trong quá trình ép viên, hoạt động tốt ở pH thấp trong điều
kiện dịch dạ dày của động vật, chống chịu đƣợc enzyme thủy phân protein nhƣ
pepsin, pancreatin để duy trì hoạt tính trong hệ tiêu hóa của vật nuôi. Một enzyme
nguyên bản khó có thể đồng thời đáp ứng các điều kiện công nghệ kể trên. Vì vậy
một hƣớng nghiên cứu mới đang đƣợc quan tâm, đó là nghiên cứu ảnh hƣởng của
cấu trúc không gian đến hoạt tính của enzyme phytase từ đó cải biến nguồn gen sẵn
có để sinh tổng hợp một enzyme đáp ứng đƣợc các yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao.
Năm 2007, Zhang và CS chỉ ra rằng liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu trúc
không gian của phân tử phytase từ A. fumigatus có vai trò rất quan trọng làm tăng
khả năng “đàn hồi” nhiệt. Đó là những liên kết mà phytase từ A. niger không có
đƣợc nên hoạt tính của enzyme này giảm hơn hẳn khi bị biến tính ở nhiệt độ cao.
Tác giả cũng khuyến cáo thay thế bốn vị trí axit amin của phytase từ A. niger theo
A. fumigatus sẽ làm tăng đáng kể hoạt tính của nó [73]. Theo quan điểm của Zhang
và CS, các nhà nghiên cứu sau đó đã thu đƣợc những kết quả thú vị khi tiến hành
cải biến gen mã hóa phytase từ chủng nấm mốc A. niger nhằm tăng tính bền nhiệt
của enzyme này [30, 39, 58, 69].
Phân tích cấu trúc của phytase chịu nhiệt cho ta cái nhìn sâu sắc về các tƣơng
tác trong phân tử góp phần duy trì sự ổn định cấu trúc, từ đó giúp cho các nhà
nghiên cứu tạo ra enzyme phytase có chất lƣợng tốt hơn. Cấu trúc phân tử của
phytase từ A. fumigatus bao gồm 435 axit amin trong đó gốc His59 đƣợc
phosphoryl hóa, liên kết với 6 phân tử N-acetylglucosamine và 614 phân tử nƣớc.
Giống nhƣ các enzyme thuộc họ Histidine acid phytase khác, enzyme thủy phân
K21-Sinh học thực nghiệm
13
K21-Sinh học thực nghiệm
14
Đặng Thị Kim Anh
Luận văn thạc sĩ
ảnh hƣớng lớn đến khả năng hồi tính của phytase A. fumigatus. Ba vùng này là
Glu35-Ser42, Gly163-Arg168, Arg248-Ser254. Vùng Glu35-Ser42 liên quan đến sự
thay thế gốc kỵ nƣớc bởi gốc axit dẫn đến khả năng tăng số lƣợng các tƣơng tác
hydro. Còn cấu trúc vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 liên quan đến các
tƣơng tác ion gây ra bởi gốc arginine [67].
Kết quả so sánh cấu trúc không gian vùng axit amin 35-42 của phytase từ
A. fumigatus so với A. niger cho thấy sự thay thế Ala35 bởi Glu35 có vai trò quan
trọng trong việc hình thành mạng lƣới liên kết hydro bao gồm 12 liên kết (Hình 1.4A, bên trái). Sự tƣơng tác giữa Glu35 và Ser42 tạo cấu trúc thòng lọng bền vững
thông qua các liên kết hydro. Ngƣợc lại, cấu trúc tại vùng này của phytase A. niger
chỉ có ba liên kết hydro (Hình 1.4-A, bên phải). Do vậy, mạng lƣới liên kết hydro
có thể là yếu tố quan trọng giải thích sự khác biệt về cấu trúc tại vùng axit amin 3542 giữa hai enzyme này. Tƣơng tự, sự thay thế Pro42 bởi Ser42 của phytase
A. fumigatus cũng đóng vai trò quan trọng. Gốc Ser42 không những tạo thêm các
liên kết hydro mà còn linh động hơn gốc Pro42 của phytase A. niger, tạo điều kiện
hình thành các tƣơng tác hydro rộng hơn của gốc Glu35. Điều này giúp chúng ta
hiểu thêm đƣợc tại sao sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, phytase của A. fumigatus
có thể khôi phục lại cấu trúc không gian của nó nhờ các liên kết hydro đƣợc phục
hồi dẫn đến hoạt tính của enzyme không bị ảnh hƣởng lớn nhƣ phytase của A. niger.
Hai liên kết cầu muối giữa hai vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 đƣợc
tìm thấy ở enzyme phytase của A. fumigatus. Hai liên kết này đƣợc hình thành do
hai axit amin arginine 168 và 248 mà ở A. niger không có nên không tạo liên kết ion
ở hai vùng này. Cả hai gốc arginine cùng tƣơng tác với gốc aspartate 244 tạo nên
cấu trúc hộp có gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn. Các cấu trúc gắn mũ nhƣ vậy có
16
Đặng Thị Kim Anh
Copyright: Tài liệu đại học ©