BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM
MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG
QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ
BASA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN
SVTH: VŨ THỊ LÊ HOÀNG
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2006-2010 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010
LỜI CẢM ƠN
h Giờ (thời gian)
Asp: Aspergillus
TCA: Tricloacetic acid
SSF: Solid State Fermentation (lên men bán rắn).
VSV: Vi Sinh Vật.
Stt: Số thứ tự
a
w
Chỉ số hoạt độ nước (activity water)
Daltons Trọng lượng phân tử
CP Chế phẩm enzyme
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Cá Basa 14
Hình 3.1 : Nấm mốc Asp.awamori 18
Hình 3.2 : Hệ thống sắc ký 28
Hình 3.3: Nội tạng cá trước khi sấy 35
Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein 59
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa 50
Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết
enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori 50
Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH 51
Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ 52
Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt 53
Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch 56
Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano
57
C 72
Bảng 4.21 : Hàm lượng protein ở nhiệt độ 60
0
C 73
Bảng 4.22: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60
0
C……………….75
Bảng 4.23: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 60
0
C 76 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme 51
Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 52
Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme 54
Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano 55
Đồ thị 4.5 : Đồ thị sắc ký lọc gel 56
Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký 58
Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf
60
Đồ thị 4.8: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40
0
64
Đồ thị 4.9: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40
0
C 65
Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH
MỤC LỤC
CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về enzyme 3
2.1.1 Khái quát chung về enzyme 3
2.1.2 Lịch sử phát triển 4
2.1.3 Tính chất của enzyme 5
2.1.3.1 Bản chất sinh học 5
2.1.3.2 Bản chất hóa học 5
2.1.4 Nguồn thu nhận enzyme 5
2.1.4.1 Nguồn enzyme động vật 6
2.1.4.2 Nguồn enzyme thực vật 6
2.1.4.3 Nguồn enzyme vi sinh vật 6
2.2 Khái quát chung về enzyme protease 7
2.2.1 Định nghĩa 7
2.2.2 Phân loại protease 8
2.2.3 Ứng dụng của protease 9
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân của enzyme 11
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 11
2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 12
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chât kiềm hãm và chất hoạt hóa 12
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12
2.2.4.5 Ảnh hưởng của pH môi trường 13
2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 13
2.2.4.7 Ảnh hưởng của lượng nước 14
2.3 Cá Basa và phế liệu trong quá trình chế biến 14
2.3.1 Đặc điểm sinh học của cá Basa 14
2.3.1.1 Phân loại khoa học 14
2.3.1.2 Hình thái 15
3.2.6.3 Tiến hành chạy sắc ký 29
3.2.7 Phương pháp điện di 31
3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ 31
3.2.7.2 Hóa chất 32
3.2.7.3 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 34
3.2.7.4 Xác định trọng lượng phân tử rotein 35
3.3 Thủy phân nội tạng cá 35
3.3.1 Xác định độ ẩm 35
3.3.1.1 Nguyên tắc 35
3.3.1.2 Dụng cụ và vật liệu 35
3.3.1.3 Cách tiến hành 36
3.3.1.4 Tính kết quả 36
3.3.2 Xác định hàm lượng tro 36
3.3.2.1 Nguyên tắc 36
3.3.2.2 Dụng cụ và vật liệu 36
3.3.2.3 Tiến hành 37
3.3.2.4 Tính kết quả 37
3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 37
3.3.4 Xác định hàm lượng Photpho 39
3.3.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 42
3.3.5.1 Nguyên tắc 42
3.3.5.2 Hóa chất và dụng cụ 43
3.3.5.3 Tiến hành 43
3.3.6 Xác định hàm lượng acid amin theo phương pháp chuẩn độ formol để
đánh giá mức độ thủy phân protein 44
3.3.6.1 Nguyên tắc 44
3.3.6.2 Hóa chất 45
3.3.6.3 Dụng cụ 45
3.3.6.4 Tiến hành 46
3.3.6.5 Tính kết quả 46
3
66
4.6.2 Thủy phân ở 50
0
C 68
4.6.2.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 68
4.6.2.2 Hàm lượng đạm amin 70
4.6.2.3 Hàm lượng NH
3
72
4.6.3 Thủy phân ở 60
0
C 73
4.6.3.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 73
4.6.3.2 Hàm lượng đạm amin 75
4.6.3.3 Hàm lượng NH
3
76
CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Bên cạnh đó các ngành này cũng góp phần gây ô nhiễm môi trường đặc biệt
là nông nghiệp và chế biến thủy sản (trấu, ruột cá…) đã gây ảnh hưởng trực
tiếp đến đời sống người dân trong khu vực đó.
Tận dụng nguồn phế liệu này làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme
protease bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn và sử
dụng enzyme này thủy phân ruột cá basa một mặt làm giảm ô nhiễm môi
Chương I: Mở đầu
2
trường, mặt khác ta thu lượng đạm để tận dụng làm thực phẩm cho gia súc là
điều khả thi
Nhiệm vụ:
Thu nhận enzyme từ nấm mốc Asp. Awamori
Khảo sát các ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Thủy phân nội tạng cá Basa
Mục đích:
Tránh gây ô nhiễm môi trường
Bổ sung lượng đạm vào thức ăn gia súc
kiếm và rẻ tiền.
Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme
thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc
biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm (bia, rượu, nước chấm,bánh mỳ…) Chương II: Tổng quan tài liệu
4
2.1.2 Lịch sử phát triển
stt
năm
Nội dung nghiên cứu, phát triển
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được protease.
Fleming phát hiện ra penicilline.
Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp. Sử dụng
glucoamylase thủy phân tinh bột.
Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công
nghệ enzyme sau này.
Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các
quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme.
Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme khác nhau.
Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời sống con người. Kỹ
thuật enzyme cố định ra đời đã đưa công nghệ enzyme lên tầm
cao mới
Bảng 2.1: Lịch sử phát triển
Chương II: Tổng quan tài liệu
5
2.1.3 Tính chất của enzyme
2.1.3.1 Bản chất sinh học
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản
ứng cả trong và ngoài tế bào.
Một gen một enzyme một phản ứng
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ
sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không
có tính chất gây độc.
Đa số enzyme hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ 20 –
45
0
Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận
enzyme
2.1.4.2 Nguồn enzyme từ thực vật
Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính
rất cao. Phần lớn gồm các loại sau:
+ Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt).
+ Enzyme papain: Từ quả đu đủ.
+ Enzyme bromelin: Từ cây dứa.
+ Enzyme ficin: Từ quả sung.
Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng
cũng gặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian
thu hoạch dài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng.
2.1.4.3 Nguồn enzyme từ vi sinh vật
Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy
mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số
lượng enzyme.
Khác với nguồn động thực vật, các loài vi sinh vật là động vật đơn bào nên
có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, số
lượng enzyme lớn…
Chương II: Tổng quan tài liệu
7
Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật,
thực vật.
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu
được lượng sinh khối sau nuôi cấy lớn. Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn
enzyme.
Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa
vào các thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng
2.2.2 Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide
+ Carboxypeptidase: xúc tác liên kết thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide
*Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH- của gốc serin
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường
hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng
+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH- trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
Chương II: Tổng quan tài liệu
9
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng
chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng
L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để thuỷ phân sâu sắc và
triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường
dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ
lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân.
Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin
của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ
phân.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm)
thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại
phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên
hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó
sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút
ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt
tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A.
candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm
tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được
dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân
một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị
cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để
Chương II: Tổng quan tài liệu
Chương II: Tổng quan tài liệu
12
2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng
độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến một mức độ nào đó, nếu tiếp
tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng
Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất,
nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng.
Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong
những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của
enzyme
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chất kiềm hãm và chất hoạt hóa
Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ
hay hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm
giảm (tính kìm hãm) hoạt độ của enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc
hiệu hay không đặc hiệu và thay đổi theo từng chất, tuy từng enzyme
Chất kìm hãm (chất ức chế) là chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ
làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme.
Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ hay hữu cơ, kể cả protein
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc
làm cho enzyme chuyển thành hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất
này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim
loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hữu cơ làm tăng hay hồi phục họat tính của
enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme và tốc độ phản
ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ
phản ứng chỉ tăng tới một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó,
mỗi enzyme có
một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…
Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng vẫn có
một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh
vật…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10
2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài
hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố
Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ
chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần
thủy phân đã hết quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích
hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt
Copyright: Tài liệu đại học ©