TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA : SINH – KTNN
*****

HOÀNG THỊ THUÝ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ HÀM LƯỢNG
MEN GIỐNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VANG TÁO MÈO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học
TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI 5- 2007


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành c¶m ơn cô giáo: TS. Đinh
Thị Kim Nhung, thầy giáo: Th.S Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình hướng dẫn
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Sinh
- KTNN đã tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian qua.
Xin chân thành c¶m ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để khoá luận hoàn
thành một cách tốt đẹp.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2007


1. Danh mục các chữ viết tắt
Nxb: Nhà xuất bản
SLTB: Số lượng tế bào
HL: Hàm lượng

2. Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của các loại quả
Bảng 3.1.2.1.a Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Bảng 3.1.2.1.c Thử hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men
Bảng3.1.2.1.d Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của
4 chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.g Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
Bảng 3.1.3.2.a. Khả năng lên men các loại đường của chủng TM4
Bảng 3.2.1 . Ảnh hưởng của hàm lượng K2S2O5 trong quá trình nhân giống
Bảng 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cao men bổ sung trong quá trình nhân
giống
Bảng 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình nhân giống
Bảng 3.2.5.Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong
quá trình nhân giống
Bảng 3.3.1. Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất
Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của độ pH đến quá trình lên men vang táo mèo
Bảng 3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên
men vang táo mèo
Bảng 3.5 Kết quả phân tích rượu thành phẩm
3. Danh mục đồ thị, biểu đồ
Biểu đồ 3.1. Tốc độ sinh sản trung bình của bốn chủng nấm men


đến nay vẫn là vấn đề cấp thiết đối với ngành sản xuất vang ở nước ta. Mặt khác
cũng rất cần phải có quy trình công nghệ hoàn thiện để có thể sản xuất loại vang
thực sự có chất lượng cao, từng bước hội nhập vào thị trường khu vực và quốc tế.
Nguyên liệu mà chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu cho lên men rượu vang là
quả táo mèo (Docynia indica). Đây là loại quả có hương vị thơm rất đặc trưng
được trồng nhiều ở các tỉnh miền núi phía bắc nước ta với tổng diện tích 40.000
ha. Nơi có diện tích trồng cây táo mèo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Lai
Châu, Sơn La. Tổng diện tích trồng cây táo mèo vẫn tiếp tục tăng trong những
năm gần đây [6].
Nhu cầu tiêu dùng đối với quả táo mèo chủ yếu là ăn trực tiếp, ngâm rượu,
ngâm dịch siro nhưng cũng chỉ chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng quả thu
hoạch, số còn lại thường chưa được sử dụng hết do nhiều nguyên nhân. Trong


khi đó ngành sản xuất vang của nước ta đang phát triển với tốc độ nhanh và
đang thiếu nguyên liệu có chất lượng phù hợp để sản xuất rượu vang có chất
lượng cao giá thành hạ. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên
cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá
trình lên men vang táo mèo”.
2. Mục tiêu của ®Ò tµi
1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang táo
mèo, tiến hành định loại chủng nấm men này bằng phương pháp phân tử.
2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men đã tuyển chọn.
3. Lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy
trình lên men vang táo mèo.
3. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica).
- Chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của ®Ò tµi
- Nghiên cứu đặc tính, sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men có khả năng lên

Có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể căn cứ vào màu sắc của sản phẩm
mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng, và tương ứng với các
loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định. Chẳng hạn vang
đỏ là loại vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm, vang trắng là vang có màu vàng rơm
đến vàng ánh, vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi.
Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit…có trong vang mà
phân thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt…

Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là vang không có
gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong vang thành
phẩm có CO2) [ 9], [ 5].
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang


Nguyên liệu để sản xuất là dịch trái cây từ các loại quả: mơ, táo mèo, vải,
dứa, lê, nho…( bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của các loại quả [6]
Tên quả

Thành phần hoá học
Nước

Đường

Axit tổng số

Pectin

Tanin


0,6

_

_

Mơ

73,8

9,0

1,1

_

_

Táo mèo

84,0

4,8

1,45

_

_



1.2.3. Cấu tạo của tế bào nấm men
Mặc dù có cấu tạo đơn bào nhưng nấm men cũng mang đầy đủ tính chất của
một cơ thể sống. Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân.
1.2.3.1. Màng
Có cấu tạo 2 lớp với tỷ lệ glucan và mannan tương đương nhau. Màng tế bào
có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm khoảng 70% trọng lượng khô của tế
bào ( 31% mannan + 29% glucan), 6-7% protein và thường protein của nó liên
kết vững chắc với các hidratcacbon, tạo thành một phức chất giàu lưu huỳnh, tồn
tại dưới dạng disunfit ( -S-S- ) hoặc sulfidrin (-SH- ). Ngoài ra màng tế bào còn
chứa lipit, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất khoáng. Trên thành tế bào
nấm men có các lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh dưỡng được đưa vào trong tế
bào và các sản phẩm trao đổi chất được thải ra ngoài môi trường xung quanh.
Nhiệm vụ của màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu
bên trong tế bào và điều hoà các quá trình trao đổi chất. Các chất dinh dưỡng
được hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào.
1.2.3.2. Nguyên sinh chất
Màng nguyên sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào, chức năng chủ
yếu của nó là chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế
bào, và nhờ có hệ enzim pecmeaza mà chất dinh dưỡng được hấp thụ và
tích luỹ lại trong tế bào.
Chất nguyên sinh của tế bào nấm men.
+ Riboxom: bao gồm 2 loại là riboxom 80S ( tồn tại trong tế bào chất) và
riboxom 70S ( có trong ty thể).
+ Ty thể có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm kích thước
và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và
trạng thái sinh lý của tế bào. DNA của nấm men là một phân tử dạng vòng có
khối lượng phân tử là 50x106 Da ( gấp 5 lần so với DNA ty thể động vật bậc



phương thức sinh sản đơn tính, là quá trình tạo thành bào tử trực tiếp từ một


tế bào riêng rẽ, không qua tiếp hợp. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi, gặp điều
kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men. Sự hình thành bào tử
túi có 2 ý nghĩa : vừa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày,
chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao
và khô hạn.
1.2.5. Những biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men rượu vang,
khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu là phát triển của nấm men để
tăng sinh khối, lúc này môi trường dịch quả cần nhiều oxi để kích thích sự sinh
trưởng của nấm men. Sau đó tạo điều kiện yếm khí để tiến hành lên men tạo
thành rượu etylic, CO2 và nhiều sản phẩm phụ khác như axit lactic, axit axetic,
glixerin…
C6H12O6

2 C2H5OH +2CO2 + Q

*Quá trình lên men rượu xảy ra theo 5 giai đoạn.
Giai đoạn 1. Hoạt hoá phân tử hexoz gồm 3 phản ứng.
Dưới tác dụng của enzim photphoglucokinase, phân tử glucoza kém hoạt
động nhận một gốc photphat từ ATP tạo thành glucozo 6P là dạng hoạt
động.
Phân tử glucozo 6P dưới tác dụng của enzim izomerase chuyển thành
dạng đơn phân của nó là fructozo 6P có cấu tạo kém bền vững hơn.
Từ fructozo 6P, bắng cách photphoril hoá nhờ tác dụng của enzim
photphofructokinase chuyển thành fructozo1,6điphotphat. Phân tử này
rất dễ bị cắt mạch cacbon.


Sự tạo thành axit lactic
Lactatdehidrogenase
Axit pyruvic
Axit lactic
Lên men rượu: gồm 2 bước
+ Nhờ enzim pyruvat decacboxylase, axit pyruvic bị khử nhóm cacboxyl
thành CO2 và axetaldehit.
+ Axetaldehit bị khử thành etanol nhờ enzim alcol đehirogenase.
- Sự tạo thành α - glixerophotphat và glixerin.
Đihidroxiaxeton P α - glixero P đehidrogenase L -α - glixero P
H2O


NADH+H+ NAD+

Photphatase

Pv
Glixerin
1.2.6 Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang, bệnh vang
1.2.6.1. Nấm men
Nấm men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae. Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các
chủng. [ 6], [ 4], [ 1].
 Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất tới 20.5
% thể tích cồn.
 Chủng lên men với thời gian ngắn, sản sinh 8-12% thể tích cồn, thậm chí
ở nhiệt độ thấp 4-10oC không bị kìm hãm.
 Chủng chịu được độ cồn cao, lên men được trong rượu vang gồm 30%
đường, hàm lượng cồn 12-15% thể tích.

-

Tạo tiền chất.

-

Thực hiện những quá trình oxi hoá - khử để biến tiền chất thành những
sản phẩm trung gian hoặc cuối cùng để xây dựng tế bào hoặc tích tụ
trong môi trường.

1.2.7.2.Nguồn nitơ vô cơ
Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào. Vì vậy, môi trường nuôi cấy nấm men
cần bổ sung hợp chất chứa nitơ mà nấm men có thể đồng hoá. Do đó trong môi
trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung
(NH4)2SO4.
1.2.7.3.Nguồn photpho vô cơ
Hợp chất photpho có vai trò quan trọng. Nếu thay đổi nồng độ hợp chất
photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng
loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào chất và chất nhân. Ngoài
ra, photpho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim
đồng hoá các loại thức ăn cacbon. Trong môi trường phân lập cũng như trong
môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung KH2PO4.
1.2.7.4. Nguồn nguyên tố khoáng khác
Muối khoáng có trong môi trường tham gia chủ yếu vào thành phần hạt
nhiễm sắc và các enzim. Vì vậy, một trong những tính chất của chúng là làm


thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất. Dưới tác dụng của muối vô cơ, bề
mặt tế bào không ngường thay đổi và dẫn đến làm thay đổi phản ứng enzim
trong quá trình trao đổi chất. Như vậy, có thể nói rằng muối khoáng có vai trò

sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydratcacbon và
nitơ [7].
1.2.8.3. Ảnh hưởng của pH
pH ở các mức khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác nhau.
pH = 2,3 thì quá trình lên men yếu, pH = 6,5-7,5 thì quá trình lên men dừng lại.
Đối với quá trình lên men vang một số loại quả pH thích hợp từ 4,0-4,5 [7].
1.2.8.4. Ảnh hưởng của hàm lượng giống
Hàm lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian
nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng
men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hơn, hạn
chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men. Nhưng hàm lượng
men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không
có lợi cho quá trình lên men và chất lượng rượu vang [7].
Nhìn chung hàm lượng nấm men giống thích hợp nhất trong dịch lên men từ
4-10 triệu tế bào/1ml dịch lên men.
1.2.8.5. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men vang là 12-25%.Hàm lượng
đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi
hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axit axetic trong vang
cũng cao. Mặt khác tỉ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng
không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả
đã cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển
của tế bào nấm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructoza và
đường sacaroza… Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có
lợi cho quá trình lên men và chất lượng của vang thành phẩm [7].

1.2.8.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hoà tan


Nồng độ oxy hoà tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinh sản và

2.1.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô
trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy ly tâm, kính
hiển vi quang học Nikon Nhật, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn nhiệt, …
2.1.3 Các loại môi trường
2.1.3.1 Môi trường Hansen (môi trường 1) g l
1. Đường glucoza :

50g

2. Pepton

5g

:

3. MgSO4.7H2O :

0,5g

4. KH2PO4

:

1g

5. (NH4)2SO4

:


(NH4)2SO4
:
Nước
:

50g
5g
0,5g
1g
1g
1000ml

2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3)g/l
1. Dịch siro hoa quả :
200ml
2. MgSO4.7H2O
:
0,5g
3. KH2PO4
4. (NH4)2SO4
5. Nước

:
:
:

1g
1g
1000ml


Phương pháp đếm số lượng tế bào dùng để xác định mật độ tế bào trong môi
trường nuôi cấy là phương pháp đơn giản, thuận tiện, cho kết quả nhanh. Dụng
cụ để đếm số lượng tế bào là buồng đếm hồng cầu Thoma- Goriaev có cấu tạo là
một khung đếm bằng phiến kính bao gồm 400 ô vuông nhỏ với tổng thể tích của
buồng đếm là = 0,1m3.
Việc đếm số luợng tế bào nấm men có trong môi trường nuôi cấy được thực
hiện đúng theo nguyên tắc đếm số lượng hồng cầu trong máu.
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giống
Các khuẩn lạc được chọn sẽ được cấy vào thạch nghiêng để ở 26-280C trong
vòng 24 giờ được giống cấp 1. Nấm men được lấy từ thạch nghiêng để đưa vào
dịch lên men. Để có số lượng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to khoẻ,
chúng tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trong môi trường nhân giống
ở 26-280C trong 24 giờ trên máy lắc, được giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên
men.
2.2.1.4.Xác định hoạt lực lên men
Chúng tôi xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua việc xác định
hàm lượng CO2 được sinh ra ( g/l dịch lên men ) khi tiến hành lên men trong các
bình tam giác với 50ml dịch môi trường lên men. Hàm lượng CO2 sinh ra càng
nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt.


Trong một số trường hợp khi nghiên cứu về nấm men ở giai đoạn nhân giống
hoặc lên men vang chúng tôi kết hợp phân tích hàm lượng cồn và đường sót để
xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men
của nấm men được đánh giá càng tốt.
Hiệu suất lên men được tính bằng công thức:
VTT
N=

x 100%

học của chủng nấm men do chúng tôi phân lập và tuyển chọn được để lên men
vang táo mèo thông qua các tiêu chí cơ bản.
Đặc điểm sinh học ( cấu tạo, hình thái, sinh lý, điều kiện hình thành túi
-

bào tử và số lượng bào tử…).
Khả năng đồng hoá cacbon.
Khả năng đồng hoá các loại muối nitrat.

2.2.2.Phương pháp hoá học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
Xác định độ pH bằng máy đo pH và giấy đo pH.
Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ dung dịch
NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng
axit dịch lên men.
Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế hoặc bằng phương pháp hoá học.
2.2.3. Phương pháp toán học
Chúng tôi tiến hành xử lý kết quả thu được bằng phương pháp thống kê toán
học qua các thông số sau:
2.2.3.1.Giá trị trung bình số học:

M

Trong đó

=

n

Mi

M

Trong đó:

CV: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể
M: trung bình tổng thể
: độ lệch chuẩn

2.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Chủng nấm men Saccharomyces tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo
được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Phòng thí nghiệm Vi sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội
Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2
2.5. THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Đề tài thực hiện từ tháng 9 năm 2005 đến tháng 12 năm 2006


CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA
CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG TÁO MÈO
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Sau 10 lần phân lập chúng tôi thu được 38 mẫu nấm men. Từ số mẫu này
tuyển chọn được 4 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn hơn 1,5mm, chúng tôi
dùng 4 chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp, các chủng này kí hiệu là TM1,
TM2, TM3, TM4.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và chất
lượng của vang. Nấm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo mèo phải đạt