TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
*********

PHAN THỊ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG
TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN
ACETOBACTER XYLINUM BHN2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

GVHD: TS. Dƣơng Minh Lam
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2012


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Dương Minh Lam đã

tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy Nguyễn Khắc
Thanh cùng toàn thể thầy cô trong tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và khuyến khích
em trong thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1
2. Mục tiêu.....................................................................................................2
3. Nội dung....................................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn...................................................................2
5. Điểm mới...................................................................................................2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum trong sinh giới.............3
1.1.1. Vị trí phân loại của chủng A.xylinum...................................................3
1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum............................................4
1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC..................................................5
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose và màng BC.....................................5
1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose....................................................5
1.2.1.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC..................................................6
1.2.2. Cơ chế tổng hợp màng BC...................................................................7
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC......................................8
1.3.1. Nguồn cacbon......................................................................................8
1.3.2. Nguồn nitơ...........................................................................................9
1.3.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng...................................................................9


1.3.4. Các chất kích thích sinh trưởng.........................................................10
1.3.5. Điều kiện nuôi cấy.............................................................................10
1.3.5.1. Độ pH..........................................................................................10
1.3.5.2. Nhiệt độ.......................................................................................10
1.3.5.3. Thời gian nuôi cấy.......................................................................10
1.3.5.4. Ảnh hưởng giữa diện tích bề mặt và thể tích nuôi cấy (tỷ lệ
S/V)...........................................................................................................11

độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị...........................16
2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng............................16
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê...................................................17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................18
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2..........18
3.1.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2.................18
3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa...............................................19
3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng......................................................19
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A.xylinum BHN2.............................20
3.1.4.1. Hoạt tính catalase.........................................................................20
3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic....................20
3.1.4.3. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trên môi
trường Blue bromphenol...........................................................................21
3.1.4.4. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose.........................................22
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường nuôi cấy khác nhau........22
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màng BC từ
chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2....................................................................23
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose...................................................23
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4.............................................25
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4.................................................27
3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4. 7H2O........................................29
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau...........31
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC............................33
3.5.2. Ảnh hưởng của pH đến hình thành màng BC....................................34


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................37
1. Kết luận.......................................................................................................37
2. Đề nghị .......................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................39


GK

: Glucokinase

FK

: Fructokinase

PC

: Plant cellulose

UGP

: Glucose-1- phosphate uridylytranseferase

1PFK

: Fructose-1-phosphatekinase

Fruc-6-P

: Fructose-1-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-phosphate

Glc-6-P



DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng A.xylinum
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của
chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của
màng BC
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khối lượng tươi của màng
BC
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4. 7H2O đến khối lượng tươi của
màng BC
Bảng 3.6. Khối lượng tươi của màng BC qua thời gian nuôi cấy
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum BHN2
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của A.xylinum BHN2
Hình 3.2. A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch đĩ a
Hình 3.3. A.xylinum BHN2 trên môi trường lỏng
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum BHN2
Hình 3.5. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn A.xylinum BHN2
Hình 3.6. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum
BHN2
Hình 3.7. Kết quả nhuộm màng BC
Hình 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khối lượng tươi màng BC

hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính
đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì
vậy màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực
công nghệ.
Trên thế giới việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC đã đạt được nhiều
thành tựu to lớn trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy, công nghệ
môi trường, công nghệ mỹ phẩm, trong y học,… Ở Việt Nam việc nghiên
cứu, sản xuất màng BC mới được quan tâm trong thời gian gần đây và mới
thu được những kết quả bước đầu (dùng màng BC đắp lên vết thương hở,
dùng màng BC đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ). Nhằm tìm kiếm nguồn
nguyên liệu có bản chất polyme sinh học để tạo cơ sở cho sản xuất màng trị
bỏng và nhiều ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ”

1


2. Mục tiêu
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2.
3. Nội dung
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường nuôi cấy khác nhau
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng
BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
3.4. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi
khuẩn A.xylinum BHN2
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí khác nhau. Theo
“Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey’s manual of systematic
bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi khuẩn acetic quan trọng là
Acetobacter và Gluconobacter. Vi khuẩn A.xylinum được xếp vào chi
Acetobacter.
Các nghiên cứu tiếp nhằm cải thiện hơn quá trình lên men và từng bước
phân loại Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng thành các nhóm khác

3


nhau đồng thời nghiên cứu đặc tính sinh học đặc trưng cũng như ứng dụng
của từng nhóm.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum
Đặc điểm hình thái - tế bào học
Chủng A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc
nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể
tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic cao vượt
giới hạn cho phép, nó sẽ gây ức chế hoạt động của vi khuẩn [4], [20], [21].
Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, chủng A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn
hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong
suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Chủng
A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình
thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại ở trong điều kiện
nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và
phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác


Hiện tƣợng

Chuyển hoá môi trường chứa
Oxy hoá ethanol thành
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
acid acetic
xanh sang màu vàng
Hoạt tính catalase
Hiện tượng sủi bọt khí
Sinh trưởng trên môi
Sinh khối không phát triển
trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch
thành dihydroxyaceton sau lên men
Vòng sáng xuất hiện xung quanh
Chuyển hoá glucose
khuẩn lạc trên môi trường chứa
thành acid
CaCO3
Kiểm tra khả năng sinh
Không hình thành sắc tố nâu
sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu
hợp cellulose
lam

Kết
quả
+

Cellulose được cấu tạo bởi các mắt xích β-D glucose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucocid, liên kết này thường không bền: Đun nóng cellulose
trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose.
(C6H10O5)n + nH2O -> nC6H12O6
Đun nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và acid sunfuric đặc
thu được cellulose nitrat.
[C6H7O2(OH)3]n + 3n HNO3 (đặc) -> [C6H7O2(ONO2)3]n + 3nH2O
1.2.1.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandecvan tạo thành

6


dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trưởng [7], [10], [30].
Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ
khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song
cấu thành mạng lưới cellulose. Do đó màng BC có độ bền cơ học cao, độ tinh
khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật [13].
1.2.2. Cơ chế tổng hợp màng BC
Khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trong môi trường có nguồn dinh
dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbonhidrate, vitamin B1, B2, B12... và các chất
kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình
bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần

nguồn cung cấp cacbon chủ yếu cho phần lớn vi sinh vật dị dưỡng. Để tránh
hiện tượng ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm đường bị chuyển hóa khi
khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm

8


1100 trong 30 phút. Để nuôi cấy vi khuẩn thường dùng 0,2 – 0,5% đường. Hầu
hết các vi khuẩn chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [2],
[6], [31].
1.3.2. Nguồn nitơ
(NH4)2SO4 là nguồn cung cấp nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát
triển của chủng A.xylinum. Khi nuôi cấy chủng A.xylinum trong môi trường có
sử dụng NH4+ sau khi đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô
cơ (SO42-, Cl-…) làm giảm pH môi trường [6]. Chủng A.xylinum có khả năng
đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, không có khả năng hấp thụ
các protein cao phân tử, chỉ các polypeptid không chứa quá 5 gốc acid amin
mới có thể di chuyển qua màng tế bào chất [2], [28]. Hàm lượng nitơ quá cao
hay quá thấp sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý hoá môi trường, vì vậy ảnh hưởng
tới quá trình tạo thành cellulose của chủng A.xylinum.
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2].
1.3.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta dùng các loại
phospho vô cơ: KH2PO4, K2HPO4, KNO3… [2]. Bổ sung phosphat các môi
trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [15].
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của chủng A.xylinum và quá trình hình thành màng BC như Mg,

Theo Thesis Holmes (2004), hàm lượng glucose giảm nhất sau 150 giờ
nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt đầu sử dụng

10


acid gluconic và 5 – keto acid gluconic trong quá trình trao đổi chất. Tác giả
cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng thái tốt nhất.
1.3.5.4. Ảnh hưởng giữa diện tích bề mặt và thể tích nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Trần Như Quỳnh khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ
lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men là 1,25 cm.
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới
Chủng A.xylinum và màng BC đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa
học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghệ
thực phẩm sử dụng chủng A.xylinum tạo màng BC dày để sản xuất thạch dừa,
màng BC để bảo quản thực phẩm. Trong công nghiệp giấy, màng BC được
dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng để làm màng lọc nước trong công
nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho các pin và tế bào năng lượng.
Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC được dùng làm mặt nạ dưỡng da. Trong
lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được nghiên cứu làm màng trị bỏng, da
nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu nhân tạo…
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng
A.xylinum ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các
nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng A.xylinum sự hình thành màng BC
và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình
tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở sản xuất thạch dừa của
Nguyễn Thúy Hương (Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách
Khoa TP. HCM). Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả Huỳnh Thị Ngọc

Thuốc thử: dung dịch fehling, dung dịch blue bromophenol.
Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugol (Việt Nam)
Ngoài ra còn sử dụng : acid acetic, NaOH 0,1N, nước dừa (Việt Nam).
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy so màu UV –
vis ( Nhật), máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ), máy lắc Orbital
Shakergallenkump (Anh), máy li tâm Sorvall (Mỹ), Micropipet Jinson (Pháp),
các loại tử 20l – 1000µl, kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ), cân (Precisa
XT 320M - Thụy sỹ), hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn
cồn,…

13


2.1.3. Môi trường nghiên cứu
Thành phần
1. Glucose
2. Agar
3. (NH4)2SO4
4. KH2PO4
5. MgSO4. 7H2O
6. Acid acetic
7. Pepton
8. Nước mía ép
9. Nước dừa
10. Nước máy

MT1
20 g
20 g

0
0
0
1000
ml

MT4
20 g
0
3g
2g
2g
2%
3g
200 ml
0
800 ml

MT5
20 g
0
5g
2g
0
2%
5g
0
0
1000
ml

Các chủng giống sau khi phân lập, sơ bộ xác định là chủng A.xylinum
BHN2 được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 300C.

14

Trích đoạn Các phương pháp hoá sinh Sinh trưởng trên môi trường lỏng Ảnh hưởng của hàm lượng glucose Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4

---