Lời cảm ơn
Nghiên cứu khoa học là một công việc cần thiết của thế hệ trẻ, đặc biệt với
mỗi sinh viên. Để đạt được mục đích và hoàn thành nội dung của đề tài không
thể tự bản thân mỗi sinh viên thực hiện, mà cần có sự tạo điều kiện của nhà
trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo, cô giáo.
Bằng tấm lòng thành kính em xin được bày tỏ tấm lòng biết ơn sâu sắc tới
cô giáo, tiến sĩ Đinh Thị Kim Nhung. Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn
các thầy cô giáo trong bộ môn vi sinh vật học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ
em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2007

Sinh viên
Trần Thị Thu Huyền


LờI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, căn cứ kết
quả thực nghiệm nêu trong khoá luận là trung thực.
Đề tài này chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2007

Trần Thị Thu Huyền


Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu, bảng, biểu đồ
1. Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu
- TB: tế bào

khác nhau
Đồ thị 3.4.1. Động thái của quá trình lên men vang táo mèo
Biểu đồ 3.1.2.4 biểu diễn hàm lượng CO2 thoát ra của chủng nấm men
S. cerevisiae
Biểu đồ 3.3.6. Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng
S. cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men của chủng ở các nồng độ NaCl
khác nhau
Đồ thị 3.3.7. Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng
S. cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men ở các nồng độ KH2PO4 khác nhau
4. Danh mục các ảnh
ảnh 1: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae trên môi trường thạch đĩa
ảnh 2: Hình thái tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trên kính hiển
vi quang học x1000 lần


mở đầu
*Lí do chọn đề tài
Rượu vang (wine,vine) là sản phẩm được tạo thành trong quá trình lên men
các loại nước trái cây không qua trưng cất, giữ được mùi thơm và hương vị đặc
trưng của từng loại hoa quả.
Ngành sản xuất rượu vang đã được con người sử dụng và sản xuất từ rất lâu
phổ biến ở Pháp, Trung Quốc. ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang đã được
con người sử dụng nhiều phát triển với tốc độ nhanh nhưng thành phần vẫn khó
được thị trường tiếp nhận, do ứng dụng công nghệ vi sinh và sản xuất vang chưa
được phổ biến nhiều, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng trong lên
men vang đã được đề cập đến nhưng còn ít. Nước ta do có khí hậu nhiệt đới nên
các cây ăn quả rất phong phú, đa dạng, trong đó có nhiều loại quả có thể là
nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang. Đặc biệt ở miền núi phía Tây Bắc
nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị rất thơm ngon và đặc trưng.
Nhưng hiện nay số lượng quả táo mèo chủ yếu để ăn tươi, ngoài ra còn

Chương 1. Tổng quan về tài liệu
1.1. Khái quát chung về rượu vang
1.1.1. Các loại rượu vang
Rượu vang là loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với hương thơm trái
cây còn giữ được trong rượu. Sự đa dạng về các loại rượu vang là kết quả của sự
biến đổi sinh hoá khi lên men. Người ta thường chia rượu vang thành hai loại
chính là vang không gaz và vang có gaz. Trong hai loại chính này rượu vang lại
được chia thành nhiều loại theo màu sắc và lượng đường có trong rượu.
- Theo màu sắc có vang trắng và vang đỏ
- Theo hàm lượng có vang khô (ít đường), vang ngọt (nhiều đường) và
vang nửa khô.
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Rượu vang theo đúng nghĩa được sản xuất từ nước ép quả nho, cho lên men
không qua trưng cất. ở nước ta với khí hậu nhiệt đới gió mùa không thích hợp
cho cây nho phát triển tốt, nhưng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt.
Đây là nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến
rượu vang (mơ, táo, dứa, vải).
1.1.3. Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:
- Cồn etanol, do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn aldehit,
este. Độ cồn của rượu từ 10-120.
- Chất bổ dưỡng: đường trong rượu vang từ 62g/l 132g/l chủ yếu là
đường fructoz, glucozo và một ít galactoz.
- Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit oxalic, axit malic, ...


- Trong rượu vang chứa một lượng phong phú các loại muối với hàm lượng
thấp nhưng giữ vai trò quan trọng, làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh
dưỡng của rượu.
- Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình

1.2.3.2. Nguyên sinh chất
- Màng nguyên sinh chất: Có chức năng chủ yếu là chủ động điều hoà việc
hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào.
- Chất nguyên sinh của tế bào nấm men:
+ Ribôxôm: bao gồm 2 loại là Ribôxôm 80S (trong tế bào chất) và
Ribôxôm 70S (trong ti thể).
+ Ti thể có dạng hạt. Kích thước khoảng 0.2- 0.6 m có màng bọc trong
suốt, tính thấm cao. Kích thước và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều
kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lí của tế bào. Ti thể được bao bọc bởi hai lớp
màng cấu tạo bởi protein và lipid và trên đó có rất nhiều hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản
(ôxixôm).
Số lượng ti thể trong tế bào nấm men từ 10-20, chúng tham gia vào quá
trình sinh trưởng tế bào sự hình thành và nảy chồi của bào tử.
- Trong tế bào nấm men có chứa một hệ thống không bào được hình thành
từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao và là nơi tích
luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào có chứa một hệ thống keo, trong
đó bao gồm cả điện tử enzim, protit, hidrat cacbon, các muối canxi, photpho,
kali,... Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên
sinh và sự thay đổi sức căng bề mặt giữa không bào và chất nguyên sinh. Trong


không bào thường xảy ra các phản ứng oxi hoá khử, nhờ hệ thống enzim
xitôcrôm oxydase trong không bào.
1.2.3.3. Nhân
Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình ôvan
hoặc hình tròn, được bao bọc bởi lớp màng nhân. Khoảng 1 2.4 m cấu tạo bởi
protein, ADN, ARN và nhiều enzim. Nhân quyết định tính di truyền và tham gia
điều khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men.
1.2.3.4. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính).

loại này chịu được đường cao. Saccharomyces cereviae dùng sản xuất bánh mì,
bia, rượu vang khi lên men đạt 10 20%V cồn .
* Khả năng lên men đường của Saccharomyces :
Sự lên men : lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kì đầu
khi môi trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy
hoá đường đến CO2 và H20. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường
còn lại ít trong môi trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen trong tế bào giảm
dần .
Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác
nhau đối với mỗi loại đường. Tốc độ lên men đường glucoz và fructoz nhanh hơn
saccaroz. Tốc độ lên men được xác định CO2 bay ra từ một thể tích môi trường
nhất định trong một đơn vị thời gian.
Nấm men sử dung rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces
cerevisiae. Thành phần gồm 75 % nước, 25% chất khô.


1.3.Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng
lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men
sinh sản trong môi trường dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy, sau đó tạo điều kiện
lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, sự lên men rượu etylic được biểu diễn
theo phương trình :
C H O 2C H OH 2CO Q
6 12 6
2 5
2

Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và
tích luỹ trong sản phẩm rượu.
Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn:

sắc trong rượu vang về vị chua, mùi,... Và có loài gây làm đục cho vang, đó
thường là các loài vi khuẩn Acetobater xylium, Acetobater aceti. Một số vi sinh
vật gây ra cơ chế làm lỏng vang khi tiếp xúc với không khí. Do vậy, để bảo quản
rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng Pasteus nhưng nó làm giảm chất
lượng rượu vang , phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến
như SO2(75-120mg/l).
1.4.4. Bệnh vang
Xuất hiện khi rượu vang tiếp xúc với không khí, được Pasteus phát hiện ra.
Khi đó nấm men dạng màng và vi khuẩn axetic làm chua rượu vang. Các bệnh
vang cũng có thể do các vi sinh vật lên men trong điều kiện hiếu khí.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men và lên
men rượu vang
1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men


1.5.1.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim
axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là
hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là:
- Sản sinh năng lượng.
- Tạo thành những tiền chất.
- Thực hiện các quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành
sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào.
1.5.1.2. Nguồn Nitơ và muối khoáng
- Nguồn nitơ: Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào.
- Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong các
quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men trong quá trình trao đổi chất ở tế bào
nấm men các ion Ca2+, Mg2+, Fe2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động.
1.5.1.3. Nguồn ôxi
Quá trình lên men trong giai đoạn đầu cần ôxi để giúp nấm men tăng sinh

Men giống là tác nhân của của quá trình lên men. Hàm lượng giống quá ít
gây hiện tượng dễ nhiễm khuẩn hoặc không lên men mạnh, nếu hàm lượng giống
quá cao lên men mạnh nhưng có sự cạnh tranh cơ chất. Hàm lượng giống thích
hợp là từ 8-10%.


Chương 2
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docyni indica) được thu nhận từ hai vùng trồng nhiều ở
Việt Nam là Yên Bái(Trạm Tấu) và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị
trí phân loại theo Yelinov N.P(1996) sau đây:
Lớp: Hemiascomycetes.
Bộ: Endomycetales
Họ phụ:Saccharomycetdideae.
Giống: Saccharomyces.
Loài: Cerevisiae.
2.1.2. Hoá chất
Các loại đường: glucoza, saccaroza, fructoza. một số chất vô cơ, hữu cơ:
KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH, HCl, (NH4)2HPO4,(NH4)2SO4. Rượu etylic,
pepton, agar, phenolphtalein, nước máy, cồn.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh.
- Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ
sấy, cân phân tích, kính hiển vi.
2.1.4. Môi trường
Dựa vào tính chất của nấm men Sacchromyces cerevisiae chúng tôi chọn


5.0g

- MgSO4.7H2O: 0.5g
- KH2PO4:

1.0g

- (NH4)2SO4 :

1.0g

- Nước cất:

1000ml.

2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3):g/l
- Dịch siro hoa quả: 50g
- MgSO4.7H2O: 1.0g
- KH2PO4:

1.0g

- (NH4)2SO4 :

1.0g

- Nước cất:

1000ml.

tôi tiến hành hoạt hoá giồng bằng cách nuôi trên môi trường thạch ở 24-280C
trong vòng 24 giờ.


2.2.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
* Phương pháp cân bình trọng lượng.
Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng
một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân
trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại.
* Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriave.
Cấy giống vào môi trường nhân giống nuôi ở nhiệt độ 280C lắc đều canh
trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường. Tuỳ mức độ giai đoạn phát
triển mà tỉ lệ khác nhau.
Dùng pipet lấy dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm kính,
chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3-5 phút rồi tiến hành
soi trên kính hiển vi ở vật kính 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau.
Cách tính số tế bào trong 1ml: M=A.50.B
Trong đó:

M: Số tế bào trong 1ml dịch huyền phù.
A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông.
B: Hệ số pha loãng.

2.2.4. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học
- Giá trị trung bình số học:

n X
X i
i1 n



Chương 3
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Tác nhân chính thực hiện quá trình chuyển hoá đường trong dịch táo mèo
là nấm men. Vì vậy, ta phải phân lập và tuyển chọn để lấy được chủng tốt nhất.
Các chỉ tiêu chúng tôi dựa vào để phân lập và tuyển chọn là:
- Chịu được độ cồn và độ axit cao.
- Tốc độ phát triển nhanh chu kì lên men ngắn.
- Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao.
- Hương thơm tạo este đặc biệt, không sinh độc tố.
- Dễ lắng trong khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định
lâu dài trong sản xuất.
Từ dịch quả táo mèo tự nhiên chúng tôi đưa vào phân lập trên đĩa petri đã
thu được 20 mẫu nấm men khác nhau. 20 mẫu này đem thử hoạt lực lên men
trong dịch táo mèo nhờ lượng CO2 thoát ra. Mẫu nào cho hàm lượng CO.2 thoát ra
càng nhiều thì hoạt lực lên men càng mạnh. Qua nhiều lần tuyển chọn chúng tôi
chọn được một mẫu nấm men có đường kính khuẩn lạc lớn, trắng bóng, lồi, bờ
không răng cưa. Được trình bày ở hình 3.1.a và hình 3.1.b


3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men
Trong lên men, hoạt lực của nấm men được biểu thị bằng hàm lượng CO2
sinh ra. Lượng CO2 sinh ra và thoát ra môi trường càng nhiều thì trọng lượng
bình lên men càng giảm, điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Tiến
hành thí nghiệm với chủng S. cerevisiae và thí nghiệm được lặp lại 8 lần kết quả
thu được sau 72 giờ lên men đã dẫn ở bảng 3.1.2.1.
Bảng 3.1.2.1. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72 giờ của chủng nấm men

lượng CO2 thoát ra nhiều (trung bình 2.40g/100ml). Sự phát triển của tế bào nấm
men làm cho vi khuẩn khó phát triển, nấm men dại khó xâm nhập.
Với số lượng CO2 thoát ra đạt trên 2g/100 ml là đạt với yêu cầu dùng cho
lên men rượu vang các loại hoa quả. Vì vậy, chủng này được nghiên cứu tiếp sự
động thái phát triển.
3.1.2.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae.
Để nghiên cứu tốc độ phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae. Trên
môi trường nhân giống, chúng tôi tiến hành theo dõi sự sinh trưởng và phát triển
của chủng S. cerevisiae bằng cách xác định số lượng tế bào nấm men/ml canh
trường.


Số lượng tế bào nấm men x 106t

140
120
100
80
60
40
20
0

0

4

8

12 20 24

150

180

210

240

270

h

120

120

120

120

120

g/l

5.2 0.1

5.6 0.1

6.3 0.1



độ
cồn

Qua bảng trên ta thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men cao thì
hàm lượng đường dịch có hàm lượng đường 270g/l thì nấm men phát triển kém.
Hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men rượu vang là 210- 240g/l vì ở
hàm lượng đường này thì độ cồn và lượng đường sót lại đạt tiêu chuẩn cho phép.
3.1.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
pH có ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình lên men của nấm men. Để xác định
ảnh hưởng của độ pH môi trường tới khả năng lên men của chủng S. cerevisiae
D1. Chúng tôi tiến hành môi trường lên men ở nhiệt độ 28- 320C, độ pH biến đổi
ở các mức 2.5; 3; 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5. Xác định hàm lượng CO2 thoát ra sau 24 h
nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm được diễn ra ở biểu đồ 3.1.2.4.


Hàm lượng CO2 thoát ra (g/l)

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0