TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
_______***_______

VŨ NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH
CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC
ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học
TS. Phương Phú Công

HÀ NỘI - 2010


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS. Phương Phú Công đã
hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hiện và hoàn
thành tốt luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong bộ môn Vi
sinh vật.
Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa
Sinh – KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh, thư viện đã tạo điều kiện giúp đỡ để
em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Ngoài ra, em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, gia đình trong
suốt quá trình làm đề tài.


..3

1.2 Hệ thống cellulase……………………………………………………… .7
1.3 Cơ chế phân giải cellulose………………………………………………. .8
1.4 Ứng dụng của cellulase………………………………………………….. .11
1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose ……………………………….. 15
1.5.1 Nấm sợi ………………………………………………………………. 15
1.5.2 Vi khuẩn……………………………………………………………… .16
1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật…

17

1.6.1 Giống vi sinh vật………………………………………………………. 17
1.6.2 Nguồn dinh dưỡng ……………………………………………………..18
1.6.3 Điều kiện nuôi cấy……………………………………………………... 19
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật……………………………………………….. 21
2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………………

.21

2.1.2 Môi trường……………………………………………………………. .21
2.1.2.1 Môi trường bảo quản và giữ giống…………………………………. 21
2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy………………………………………………… 22
2.1.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme…………………………………… 22
2.1.3 Hóa chất- thiết bị……………………………………………………… 23
2.1.3.1 Hóa chất…………………………………………………………….. 23
2.1.3.2 Thiết bị………………………………………………………………. 23
2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….. 23

Bảng 1.1 Các thành phần chính của ligno – cellulose và các enzyme phân giải
của nấm………………………………………………………………………. .4
Bảng 1.2 Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu……………………..7
Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose(D-d, cm)..28
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase………………………….31
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase…………………….34
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase…….36
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase…………....38
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên…………………………...41


DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1 Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose……………………………………..5
Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose……………………………………………………...6
Hình 1.3 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973………………..10
Hình 3.1 Khả năng sinh cellulase của các chủng được nghiên cứu………………...29
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase…………………………..32
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase…………………………..34
Hình 3.4 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3 và AspergillusM5-3 ở
25 0C…………………………………………………………………………………...34
Hình 3.5 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3 và Aspergillus M5-3 ở
30 0C…………………………………………………………………………………..35
Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính cellulase………………………….36
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase…………………..38
Hình 3.8 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3 trên nguồn nitơ là
(NH4 )2SO4 và NaNO3………………………………………………………………....39
Hình 3.9 Khả năng sinh cellulase c ủa chủng AspergillusM5-3 trên nguồn nitơ là
(NH4 )2SO4 và NaNO3…………………………………………………………………39
Hình 3.10 Khả năng sinh cellulase của chủng A. niger M6-1 trên nguồn nitơ là

MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hàng
ngày. Các quá trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực
phẩm…đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi
khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật, thì việc ứng dụng nó trong
sản xuất và đời sống hàng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả lớn [8].
Cellulose là thành phần chủ yếu của màng tế bào thực vật. Hàng ngày,
hàng giờ, một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản phẩm
tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống…Nếu không
có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ
tràn ngập trái đất. Trong thiên nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng
phân hủy cellulose nhờ có hệ enzyme cellulase ngoại bào như: vi khuẩn(
Pseudomonas, Xenllulomonas, Achromobacter, Clostridium.), xạ khuẩn
(Streptomyces..).Trong đó, vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó
tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme đầy đủ các thành phần, đặc biệt là
các loài nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh hơn cả như
Aspegillus, Mucor, Tricoderma…
Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai, người ta sử dụng
cellulase cho hai mục đích chính:
- Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghiệp thực
phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ
môi trường.
- Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng
khác nhau.

Vũ Ngọc Mai

1

nhân gây ô nhiễm môi trường. Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức
ăn gia súc hoặc phân bón thì đó cũng sẽ là một nguồn lợi lớn.Trên thế giới
cũng như ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về cellulose ứng dụng trong
thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình và CS (2002) đã ứng dụng các
chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia

Vũ Ngọc Mai

2

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

súc [1]. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách
sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức
ăn cho gà, lợn, bò... và kết quả cho nhiều triển vọng [4].
Nghiên cứu của tôi tập trung vào phân lập, tuyển chọn, các chủng nấm
mốc có khả năng phân giải cellulose nhằm tìm ra các chủng có triển vọng ứng
dụng trong việc xử lí phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc.
2 Mục đích nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase của các chủng nấm mốc đã được tuyển chọn.
3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy ở một số nơi
như: Xuân Hoà, huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên (Vĩnh Phúc) được sử

Đơn phân tử

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

40 – 50

25 – 40

20 – 35

D – anhydrogluco

Xylose

Coniferyl alcohol

pyranose

Mannose

ρ – counmaryl alcohol

Hexoses

Sinapyl alcohol



(E.C. 3.2.1.8)

1.11.1.7)

đến phân giải

Cellobiohydrolase

và hydrolases

Mn phụ thuộc vào

(E.C. 3.2.1.91)

khác

peroxidase (E.C. 1.11.1.7)

β - glucosidase

Laccase (E.C.1.10.3.2)

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật.Tổng lượng của
chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên trái đất. Về cấu trúc hóa học
của cellulose là một polyme mạch thẳng do các D-gluco-pyranose liên kết với
Vũ Ngọc Mai

4


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose
Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:
- Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao nên bền vững với tác động bên
ngoài.
- Vùng vô định hình do cấu trúc không chặt chẽ nên kém bền vững hơn.
Vùng vô định của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên.Trong khi
đó các mạng lưới liên kết hydro ở vùng kết tinh lại ngăn cản sự trương này,
nên enzyme chỉ tác động lên bề mặt các sợi.
Mặc dù với những phương pháp hiện có chưa đủ để xác định chính xác
cấu tạo của cellulose nhưng có thể thấy có rất nhiều kiểu gián đoạn và kết
thúc chuỗi, các bề mặt dị dạng và các vùng xoắn hoặc phân nhánh dọc theo
các vi sợi. Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose rõ ràng là không có sự
khống chế chặt chẽ nào để cho mọi sợi đều có chiều dài như nhau. Các sợi
riêng biệt có thể nằm trong nhiều vùng kết tinh, dẫn đến xảy ra nhiều chuỗi
kết thúc bất ngờ ngay trong vùng có độ kết tinh cao.

Vũ Ngọc Mai

6

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp


Vỏ hạt

60

Vỏ đậu tương

51

Bông

91

Mía

34

Gỗ thông

41

Cây trưởng thành

42

Giấy báo

40÷80

Bã sắn

Khóa luận tốt nghiệp

Trong các phế liệu cellulose thường có mặt trong các dạng sau:
- Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi thân cây ngô…
- Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã
sắn…
- Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
- Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2 Hệ thống cellulase
Để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự hiệp trợ của
các enzyme trong phức hệ cellulase. Phức hệ cellulase bao gồm 3 loại enzyme
chủ yếu:
- Endoglucanase (EC.3.2.1.4

β-Dglucan

glucanolhydrolase

hay

Carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase): có khả năng cắt đứt cellulose
các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi
nhưng đường khử tăng chậm do chúng thủy phân liên kết β-1,4glucozid một
cách tùy tiện trong mạch cellulose và giải phóng cellulodextrin, cellobiose.
Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng cellulose
vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh. Enzyme này được cho
là enzyme C x. Chính nhờ sự cắt trước của endoglucanase đã tạo ra các đầu
không khử, tạo điều kiện dễ dàng cho cellobiohydrolase do đó mà thủy phân
hoàn toàn được cellulose kết tinh.
- Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 β- glucan – celobiohydrolase viết tắt là

các chất cảm ứng của cellulase.
1.3 Cơ chế phân giải cellulose
Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm 1952
như sau:
Cellulose
tự nhiên

C1

Cellulose
hoạt động

Đường
hòa tan

Cx

Cellobise

Glucose

Theo tác giả này thì enzyme C 1 (tương ứng với exoglucanase) là “tiền
nhân tố thủy phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tự
nhiên thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, sau đó enzyme C x
(tương ứng với endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hòa
tan cellodextrin và cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose
dưới tác dụng của cellobiase.

Vũ Ngọc Mai


10

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

còn CBHII tấn công vào đầu không khử) lần lượt tách các cellobiose ra khỏi
chuỗi polyme. Khả năng làm giảm mức polyme hóa của exoglucanase chậm
song hàm lượng đường khử lại tạo ra nhiều. Trong khi đó endoglucanase phân
cách mạch polyme tùy tiện, không theo trật tự nào, tạo ra các chuỗi
oligosaccarit ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polyme hóa của cellulose.Trong
quá trình cắt gẫy mạch polyme, endoglucanase tạo ra các đầu khử và không
khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cắt thành cellobiose. Bởi vậy, khi có tổ
hợp endo- exoglucanase quá trình phân giải cellulose mạnh lên nhiều.
Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá
trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme. Hiệu ứng này
đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng. Các kết quả quan trọng
thu được như sau:
1. Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình phản
ứng và sự giảm đáng kế của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi cấu
trúc của cơ chất cellulose.
2. Độ kết tinh của cellulose toàn phần vô định hình ví dụ: cellulose đã xử
lí axit photphoric thay đổi không đáng kể và vận tốc cao được duy trì trong
quá trình thủy phân.
3. Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng
kể trong quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi
không đáng kể.

trình tái sử dụng cho hiệu quả và lợi dụng chất thải cellulose như là nguồn cơ
chất rẻ tiền.
Cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase
cho 2 mục đích chính:
- Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghiệp thực
phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường.
- Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng
khác nhau.
Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:
- Công nghiệp chế biến thực phẩm:
+ Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.
+ Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau quả.
+ Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.

Vũ Ngọc Mai

12

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Chế biến thạch từ rau câu.
+ Sản xuất rượu và một số axit hữu cơ.
- Công nghiệp dược phẩm:
+ Chế biến các chất tự tiêu hóa, loại bỏ các sợi không mong muốn.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

mạnh như đá mài, hơn nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50% do đã loại bỏ
50% thể tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài.
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực
trên các giấy phế thải thay thế dùng Cl hoặc ClO2 gây ô nhiễm môi trường.
Để làm sạch, trắng giấy người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase,
xylanase từ Sporotricchum pulverulentum, S. dimorphosphorum, cellulase từ
A. niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporium, hoặc mannase từ T. reesei.
Cellulase thường được dùng ở (0.001÷0.1%), cellulase (0.05÷0.5%),
cellobiase (0.005÷0.015%).
Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa. Tác dụng của cellulase
trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải trở nên mịn
đẹp, mềm sáng màu hơn. Cellulase thường được sử dụng kết hợp với lipase
(loại bỏ mỡ) và protease (loại bỏ protein). Các enzyme này dùng cho chất giặt
đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm.
Cellulase còn được sử dụng có hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật
trong kỹ nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài
hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông
nghiệp.
*Ứng dụng của Cellulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi
là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao
nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ
sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme
có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn,
giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn

tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hằng năm người ta sản xuất
khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme. Chiếm
khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức ăn
chăn nuôi như: GS. Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò...
kết quả thấy có nhiều triển vọng [4]. Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc…[1]. Gần đây, đã có nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng
của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease,

Vũ Ngọc Mai

15

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

xylanase, cellulase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn
của lợn con cai sữa. Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ
sung chế phẩm phytase và tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối
chứng tương ứng là: 13.3% và 32%. Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm
này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50%
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay
ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên

cũng gây lên sự tổng hợp cellulase. Bổ sung nhiều lần với một lượng nhỏ
sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lượng lớn.
Sorbose một loại đường không khử và không phải là sản phẩm của quá
trình thủy phân cellulose cũng có vai trò điều hòa sinh tổng hợp và giải phóng
cellulase.
Lactose là chất cảm ứng hòa tan cho phức hệ enzyme cellulase của
Trichoderma lignorum. Tween-80 (0,1%) có ảnh hưởng tốt đến sinh tổng hợp
cellulase của Aspergillus terreus.
Nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Krebs (axit xitric, suxinic …) là
những chất ức chế quả quá trình sinh tổng hợp cellulase. Alcol phenethylic
(PEA) là chất kìm hãm sinh trưởng và kích thích sinh tổng hợp cellulase của
Myrothecium verucaria. Một số hợp chất hóa học khác có cấu trúc tương tự
PEA như alcol benzylic, propylic, axeton cũng có tác dụng thúc đẩy sinh tổng
hợp cellulase. PEA tác động đến tế bào chất và thành tế bào, nơi xảy ra quá
trình sinh tổng hợp cellulase.
Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các chi:
alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Coprinus, Myrothecium. Penicillium,
Rhizopus, Trichoderma,…
1.5.2 Vi khuẩn
Bacilus subtilis tổng hợp CMC-ase tốt nhất trên môi trường có chứa chất
cảm ứng là D (+) raffinose 0,2%. Các chất kìm hãm là glucose và cellobiose.
Sinh tổng hợp CMC-ase của Acetivibrio cellulolyticus được cảm ứng bởi
cellulose, cellobiose và salicin b ị kìm hãm nhưng không hoàn toàn bởi
glucose. Hoạt tính exoglucannase được tăng cường nếu nuôi cấy trên poly β glucozid polyme tan hay không tan và bị kìm hãm bởi sự tăng thêm
cellobiose.

Vũ Ngọc Mai

17