Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
Vi sinh vật (Microorganisms) là tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,
muốn thấy rõ đợc ngời ta phải sử dụng tới kính hiển vi. VSV phân bố rộng
khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đáy biển sâu đến độ cao hàng nghìn mét trong
không khí, từ trong cơ thể thực vật, động vật đến các vật liệu khô cằn nh
kính, sắt đều phát hiện thấy sự sống của VSV. Tuy nhiên đất vẫn là nơi c
trú phổ biến nhất của các nhóm VSV kể cả thành phần và số lợng. Bởi thế
chúng đóng vai trò quan trọng, trớc hết là đối với quá trình hình thành và
phát triển của đất. Chính nhờ những VSV tự dỡng đầu tiên mà thành phần
của đá mẹ bị phân huỷ dần thành đất. Sự hoạt động tiếp theo của các nhóm
VSV khác đã hình thành và tích luỹ chất mùn làm nên độ phì nhiêu của đất.
VSV tham gia mạnh mẽ vào quá trình chuyển hoá vật chất trong đất, góp phần
khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Hầu hết các khâu của các
chu trình chuyển hoá vật chất trong đất đều có sự tham gia của VSV.
Trớc hết là nhóm VSV tham gia vào quá trình phân huỷ cellulose- một
hợp chất hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể
thực vật. ở cây bông cellulose chiếm 90% trọng lợng khô, ở các loài cây gỗ
khác cellulose chiếm 40-50%. Có nhiều nhóm VSV có khả năng phân giải
cellulose c trú trong đất nh vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn.
Đáng chú ý nhất là xạ khuẩn (Actinomycetes). Chúng phân bố rộng rãi trong
đất, tham gia vào nhiều quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ: cellulose,
tinh bột góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính
này đợc ứng dụng trong quá trình chế biến, phân huỷ rác, xử lý các bã thải
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm.
Từ những lý do trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phơng pháp nghiên
cứu VSV nói chung, phơng pháp nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose nói

phân giải cellulose.
4. ý nghĩa của đề tài
Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phơng thức canh tác, cày xới,
cải tạo đất, bón phân theo hớng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng
cờng các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dỡng cho
đất, tăng năng suất cho cây trồng. Mặt khác đề tài cho phép tuyển chọn những
chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh, từ đó có thể tạo ra một
chế phẩm VSV chứa các chủng xạ khuẩn này phục vụ cho việc ủ rác sinh học.

Đại học s phạm H Nội 2

2

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 1

tổng quan ti liệu
1.1. Sơ lợc về các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose
Tất cả các nhóm VSV phân giải cellulose đều thuộc nhóm dị dỡng,
hoại sinh. Chúng có khả năng này nhờ có hệ enzym cellulose ngoại bào.
Trong đất các nhóm VSV này gồm nhiều loại khác nhau: vi khuẩn, niêm vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc
Vi nấm là nhóm có khả năng phân giải cellulose vì nó tiết ra môi trờng
một lợng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính phân
giải các cellulose đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi

lạc nhày ớt, tế bào hình que, nhỏ bé (0,3 - 0,4ì 0,7 - 10m), hơi uốn cong,
thờng có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các
vi khuẩn khác. Niêm vi khuẩn phân giải cellulose đợc tìm thấy trong các
giống: Promyxobacterium, Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium. Chúng
sống trong môi trờng ít axit và ít kiềm. Trên bề mặt các vật liệu chứa
cellulose, niêm vi khuẩn phát triển trong dạng các thể nhày không có hình xác
định, lan rộng, có màu vàng, da cam hay đỏ. Màu sắc khuẩn lạc thờng tơng
ứng với các chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít. Xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose mạnh, nó tiết ra đầy đủ 4 thành phần của hệ enzym
cellulose. Vì vậy nó có khả năng phân giải cellulose mà không phải sống
trong mối quan hệ hỗ sinh với bất kì loài nào khác. Xạ khuẩn phân giải
cellulose gồm các giống: Proactinomyces, Actinomyces, Micromonospora,
Streptomyces
1.2. Sơ lợc về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí của xạ khuẩn trong hệ thống sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm VSV lớn trong giới Bacteria.
Chúng thuộc nhóm VSV Gram (+) và là nhóm chuyển tiếp giữa Nấm (Fungi)
và vi khuẩn (Bacteria). Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn (Actinomycetes)
đợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển,
có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi kém phát
triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu). Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nh họ
Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài nh họ
Streptomycetaceae. Xạ khuẩn đợc Bergey xếp vào bộ riêng Actinomycetales
(Bergeys Manual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria,
Ngành Firmicutes, Lớp Actinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae...
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm VSV nhân
nguyên thuỷ (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân

Đại học s phạm H Nội 2


trờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tuỳ theo loài, môi
trờng nuôi cấy mà kích thớc màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau nh: đỏ,
da cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám Khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì,
có dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thờng có cấu trúc ba lớp:
lớp ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong
có cấu trúc tơng đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hớng sinh trởng
trong môi trờng tạo ra hệ sợi cơ chất (HSCC) và ngoài mặt môi trờng tạo ra
hệ sợi khí sinh (HSKS). Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng
0,2-1,0m đến 2,0-3,0m. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh,
không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nớc
hoặc trong các dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thờng là các chuỗi bào tử
có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng Đây là một đặc điểm khá quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục,
hình que, hay hình trụ Cấu trúc bề mặt bào tử có thể là nhẵn (Smooth), có
gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair- like)
Hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ
tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn.

Đại học s phạm H Nội 2

5

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh


Nhóm 2 (Type II): Có chứa Meso-Diaminopimelic (Meso-ADP) và
glycine. Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella,
Dactilosporangium.
Nhóm 3 (Type III): Có chứa Meso- Diaminopimelic (Meso-DAP). Gồm
có Actinomadura, Actinobigfida, Dermatophilus, Geodermatophilus,
Nocardiopsis, Micronobispora
Nhóm 4 (Type IV): Có chứa Meso-Diaminopimelic (Meso-DAP). Gồm
có

Nocardia,

Oerskovia,

Promicromonospora,

Pseudonocardia,

Rhodococcus, Mycrobacterium

Đại học s phạm H Nội 2

6

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh



Đại học s phạm H Nội 2

7

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

nóng, nghèo dinh dỡng có số lợng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng
10.000 - 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố
của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào độ pH của đất. ở các đất có độ pH
trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất
có độ pH quá kiềm hoặc quá axit (chua). Đồng thời số lợng xạ khuẩn còn
phụ thuộc vào các thời điểm trong năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần
phải chú ý tới các điều kiện nh thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy
mẫu, độ ẩm, nhiệt độ
1.2.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa quan trọng trong tự
nhiên bởi vai trò tích cực trong việc tham gia vào các quá trình chuyển hoá
những hợp chất trong đất, nớc. Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh,
có 60%-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này nh: Atinoplanes,
Streptoverticinnium, Streptomyces các chất kháng sinh có giá trị do chúng
sinh ra đợc sử dụng rộng rãi trong y học. Mặt khác xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose trong bã thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nhằm
ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ.

khác.
Waksman và Henrici (1953) đã đa ra một hệ thống phân loại, đến năm
1961 đợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành
nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces. Krassinilcov từ năm 1941-1949 đã phát hiện trên 38 loài mới.
Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống
công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn đợc phân thành 6 họ gồm 26 chi.
Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống phân loại mới này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào
tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này đợc chỉnh lý và tái bản năm 1983.
Càng ngày, số lợng hệ thống phân loại xạ khuẩn càng nhiều nh hệ thống
phân loại của Prihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống
phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Và để thống nhất trong cách
mô tả, ISP (Iternational Streptomyces Project) đã nêu lên phơng pháp môi
trờng mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966).
1.2.5.2. Một số phơng pháp cơ bản trong phân loại xạ khuẩn hiện nay
1.2.5.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Hầu hết các chi xạ khuẩn đợc mô tả hiện nay phân chia khác nhau tuỳ
thuộc vào sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nh: màu

Đại học s phạm H Nội 2

9

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh


10

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Trớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đợc coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn nhng do chính cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài
khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy ngày nay trong phân
loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nh: đặc điểm sinh lý,
sinh hoá, miễn dịch học, sinh học phân tử.
1.2.5.2.2. Đặc điểm hoá phân loại
Trong 20 năm trở lại đây việc sử dụng các thông tin về thành phần hoá
học của tế bào đã đợc ứng dụng rộng rãi để phân loại Procaryota. Hoá phân
loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
Type thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
dây nối peptit, đờng trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế
bào.
Type Peptidoglucan (PG).
Type phospholipit.
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hớng phân loại sinh hoá, ngời ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 type sau:
Type 1: Thành tế bào có LL- DAP và glixerin.
Type 2: Thành tế bào có m- DAP và glixerin.

sinh lý, sinh hoá để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức
sau:
SAB= S*100/(nS +nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể
nS: Tổng số các đặc điểm dơng tính của hai chủng so sánh
nd: Tổng các đặc điểm dơng tính của chủng này mà âm tính của chủng
kia
Kết quả của sự so sánh này đợc biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tuỳ thuộc vào
mức độ giống nhau mà các VSV đợc xếp vào các nhóm.
* Nghiên cứu về phát sinh chủng loại: Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng
loại mà các VSV đợc xếp vào hệ thống phân loại gần nh tự nhiên hơn. Các
nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng
cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein mà quan trọng
hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ giống nhau giữa hai
cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng.

Đại học s phạm H Nội 2

12

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

1.3. Cellulose và Cellulase
1.3.1. Cellulose


1.3.2. Cellulase
Enzym cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hoá cellulose thành các
sản phẩm hoà tan, dễ sử dụng (hấp thu). Hệ thống cellulase bao gồm 3 loại
chính sau:
Endo--glucanase

hay

1,4--D-glucan

glucan

hydrolase,

cellobiohydrolase (CBH), CMC- ase (Cx): Enzym này tấn công vào các điểm
khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC, cellulose trơng phồng, các cellooligosaccarit. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu nhiên, sản
phẩm tạo thành là glucose và các oligosacarit (có thể từ 3-6C hoặc nhiều hơn).
Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase
hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết tinh đợc phân giải triệt để, hiệu quả.
Exo--glucanase hay 1,4--D-glucan cellobio hydrolase, Avicelase:
enzym này tấn công vào đầu không khử (non-reducing end) của cellulose và
kết quả là tạo ra các cellobiose.
-glucosidase hay cellobiose: Thuỷ phân cellobiose và một vài cellooligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của -glucosidase mạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi.
1.3.3. Hệ enzym phân giải cellulose
Sở dĩ một số nhóm VSV phân giải đợc cellulose là nhờ phức hệ enzym
cellulose gồm 4 enzym khác nhau tác dụng với các mối liên kết của đại phân
tử cellulose. Đầu tiên enzym cellobiohydrolase (enzym C1) có tác dụng cắt đứt
liên kết hydro, biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng


15

Cellobiose

-1,4glucozit

Glucose

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 2

vật liệu v phơng pháp
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất lấy từ đất đồi Đại Lải thuộc phờng Đồng Xuân- thị xã
Phúc Yên- tỉnh Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hoá chất
Các hoá chất: KH2P04, MgSO4. 7H20, NH4Cl, KN03, NaN03, (NH4)2SO4,
NH4NO3, NaCl, NaOH, HCl, FeSO4. 7H20, CaC03
Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, cazein, CMC (Cacboxyl
Methyl Cellulose), cao thịt
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, bàn trang, pipet, đèn cồn, bình tam giác,
giá đựng ống nghiệm.


: 1 lít

K2HPO4

: 1g

pH

: 7,0

Glucose

: 30g

FeSO4.7H2O

: 0,01g

KCl

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

CaCO3

: 3g

: 1g

pH

: 6,8

- MT Czapeck (nguyên gốc)
Sacarose

: 30g

KCl

: 0,5g

FeSO4

: 0,01g

NaNO3

: 3g

K2HPO4

: 1g

Nớc cất

: 1000ml

K2HPO4

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

MgSO4.7H2O

: 0,05g

Nớc cất

: 1000ml

pH

: 7,4

* MT nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose
- Môi trờng 1:
Pepton

: 5g

Nớc cất

: 1000ml


: 20g

pH

: 6,5- 7,0

- Môi trờng 2:

Chuẩn bị nớc chiết đất:
1kg đất+ 1 lít nớc sạch
Hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp
Bổ sung thêm 1g CaCO3 rồi lọc lấy nớc trong

Đại học s phạm H Nội 2

17

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp lấy mẫu (Nguyễn Thành Đạt 1990)
Trên mỗi loại đất dùng dụng cụ lấy đất ở các độ sâu theo thứ tự 5cm,
10cm, 20cm. Sau mỗi lần lấy một mẫu đất thì lấy khoảng 100g cho vào túi
nilon, trên túi có ghi độ sâu lấy mẫu sau đó buộc túi lại để tránh bay hơi nớc
và tránh các VSV lạ xâm nhập vào. Các mẫu đất lấy ở một địa điểm cho chung

18

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

* Cách tiến hành: Cân 10g đất khô trong không khí, cho vào bình tam
giác có dung tích 250ml, rót thêm vào đó 50ml dung dịch KCl 1N, lắc đều
trong 30 phút. Để yên cho lắng trong, lọc gạn trên giấy lọc xếp nếp. Lấy phần
nớc trong đem đo pH trên máy đo hãng Horiba (độ chính xác đến 0,01).
2.2.4. Chuẩn bị môi trờng phân lập và bảo quản
Đầu tiên, bao gói các dụng cụ thí nghiệm đã đợc rửa sạch và làm khô.
Tiến hành khử trùng bằng nồi hấp (ở áp suất 0,8-1atm trong thời gian 3045 phút) rồi đa sang tủ sấy. Cùng với thời gian đó tiến hành cân các hợp chất
để làm môi trờng, chọn môi trờng Czapeck-tinh bột, bình đựng môi trờng
phải đảm bảo đã đợc rửa sạch và khử trùng trớc đó, độ cao của môi trờng
trong bình chỉ chiếm 2/3, sau đó nút bông và bao miệng bình. Tiếp theo cho
bình đựng môi trờng vào nồi hấp, khử trùng theo phơng pháp Pasteur. Giấy
lọc đợc cắt tròn có diện tích bằng diện tích đáy hộp petri, rồi cho vào hộp
lồng bao gói cẩn thận đem khử trùng cùng với các dụng cụ thí nghiệm. Tất cả
các dụng cụ thí nghiệm và môi trờng hấp, sấy liên tiếp trong 3 ngày:
Ngày 1: Để tiêu diệt VSV
Ngày 2: Để tiêu diệt các bào tử
Ngày 3: Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trờng sau khi khử trùng đổ ngay ra hộp petri đã khử trùng, bề dày
của môi trờng trong mỗi hộp petri khoảng 3- 4mm là đủ. Sau khi đông, trên
bề mặt thạch thờng có một số giọt nớc cần tiến hành sấy khô bề mặt thạch
trớc khi cấy bằng cách: Cho nhiệt độ tủ sấy lên cao để khử trùng tủ, sau đó

theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ
pha loãng thích hợp. ở đây tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5. Dùng pipet
vô trùng hút 0,5ml dung dịch đất có độ pha loãng 10-5 nhỏ lên bề mặt thạch
trong hộp petri, lấy bàn trang thuỷ tinh gạt đều giọt dịch này lên khắp bề mặt
thạch. Sau đó đặt một miếng giấy lọc đã vô trùng lên trên và dùng bàn trang
thuỷ tinh vô trùng làm cho giấy lọc dính sát vào bề mặt thạch. Với độ sâu
5cm, 10cm, 20cm, ở mỗi độ sâu tiến hành cấy vào 5 đĩa petri nh vậy có 15
đĩa petri. Sau đó dùng giấy báo gói các hộp petri, đánh dấu và đa vào giữ
trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-300C. Sau 7 ngày mang các hộp petri ra qua sát
khuẩn lạc trên môi trờng thạch. Ta có thể thấy những chỗ xuất hiện khuẩn
lạc giấy lọc bị bào mòn, nhìn thấy cả sợi giấy. Đếm số lợng các khuẩn lạc xạ
khuẩn mọc trên khoang giấy lọc.
* Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút chì chia đáy hộp thành nhiều phần sau đó lần lợt đếm số
lợng khuẩn lạc theo từng phần nhỏ. Cũng có thể dùng những thiết bị đặc biệt

Đại học s phạm H Nội 2

20

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

để đếm số lợng khuẩn lạc một cách thuận lợi hơn. Các thiết bị này có thể chỉ
là một bản gỗ chia ra thành nhiều ô nhỏ có thể lắp một kính lúp phía trên,
cũng có thể lắp một bút điện hoặc máy bấm đặc biệt giúp cho việc ghi một

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

2.2.7. Phơng pháp xử lý số liệu bằng thống kê toán học
Tính giá trị trung bình
n

X=M=
i =1

Xi
n

Trong đó:
M: Giá trị trung bình tổng thể
Xi: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 n
n: Số lần thí nghiệm
2.2.8. Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn (Krassinicov 1970, Gause
1983, Waksman 1961)
2.2.8.1. Phơng pháp xẻ rnh thạch
Cấy xạ khuẩn lên môi trờng dinh dỡng trong hộp petri bằng cách trải
dày bằng que trang. Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp petri. Đặt
một hoặc hai lá kính vô trùng lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri
để vào tủ ấm 280-300C trong 7-14 ngày. Lấy ra quan sát và chụp ảnh cuống
sinh bào tử, hệ sợi dới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần.
2.2.8.2. Phơng pháp khối thạch

Đại học s phạm H Nội 2

23

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 3

Kết quả v thảo luận
3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn
Theo phơng pháp lấy mẫu nh trên tôi đã thu thập đợc 3 mẫu đất ở 3 độ
sâu khác nhau trong khu vực đất đồi Đại Lải:
1. Độ sâu 5cm
1. Độ sâu 10cm
2. Độ sâu 20cm
Sau khi thu mẫu tôi đã tiến hành xác định độ ẩm, độ pH của các mẫu
đất phân lập xạ khuẩn (theo phơng pháp của Nguyễn Lân Dũng) tại phòng thí
nghiệm vi sinh, khoa sinh- KTNN trờng ĐHSP Hà Nội 2. Căn cứ vào mật độ
xạ khuẩn trong các mẫu, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5 của các mẫu
đất để phân lập, mỗi mẫu đất đợc phân lập trên 5 hộp petri. Sau 5- 7 ngày lấy
ra quan sát những khuẩn lạc mọc đợc trên giấy lọc tức có khả năng phân giải
cellulose vì giấy lọc có cấu tạo từ cellulose, các VSV này đã tiết ra hệ enzym
cellulose để đồng hoá nên phát triển đợc trên giấy lọc.
Theo lý thuyết, trên môi trờng Czapeck, cả xạ khuẩn, nấm mốc và một
số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân
giải cellulose. Nhng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: khuẩn lạc vi


Số lợng xạ

Số lợng

lạc trung bình

khuẩn trong

xạ khuẩn

trong 1 hộp petri

1g đất khô

trung bình

6,0

1

2,10.105

7,2

6,05

1

2,15. 105


20

7,9

6,1

1,3

3,02. 105

5

8,1

6,2

1,4

3,45. 105

10

8,2

6,2

1,6

3,85. 105


2,27. 105

2,71. 105

3,85. 105

Qua kết quả phân lập xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải
đợc thống kê ở bảng 3.1 có thể rút ra một số nhận xét sau:
Sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi
Đại Lải là rộng. Số lợng của các nhóm này trong 1g đất khô dao động từ
2,10.105- 4,26.105. Theo những kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đã đợc
khẳng định từ trớc tới nay của nhiều tác giả trong và ngoài nớc thì xạ khuẩn
là VSV hoại sinh, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trởng và phát triển
của xạ khuẩn là 25-300C, độ ẩm thích hợp từ 40-55%, độ pH trung tính hoặc
kiềm nhẹ. Trên cơ sở này tôi phân tích lý giải sự khác nhau của mật độ xạ
khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu đất nh sau:
Đất đồi Đại Lải là loại đất feralit đỏ vàng, bị xói mòn, rửa trôi mạnh,
kết von và trơ đá. Loại đất này rất nghèo chất dinh dỡng, ít cây cối mọc
đợc, chỉ có bạch đàn, keo lá tràm và một lớp cỏ mọc thấp, tha thớt. Đất lại

Đại học s phạm H Nội 2

25

K31B Sinh