TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN NGUYỄN THỊ THU HUYỀN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH
CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT TẠI
MINH TRÍ, SÓC SƠN, HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG
HÀ NỘI, 2014


tạo mọi điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện đề tài nghiên
cứu và hoàn chỉnh luận văn này.
Tập thể các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh- KTNN, Trường
Đại học sư phạm Hà Nội 2, luôn giúp đỡ và có những góp ý sâu sắc trong thời
gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, người thân và gia đình đã
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Huyền
CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP : Diaminopimelic Acid
CFU : Colony Forming Unit
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
DNA : Deoxyribonucleic Acid
HSCC : Hệ sợi cơ chất

Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa CMC 31
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa bột giấy 32

DANH MỤC HÌNH Hình 3.2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu 28
Hình 3.3. Một số chủng xạ khuẩn phân lập được 28
Hình 3.4. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập được 30
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase các chủng xạ khuẩn 34
Hình 3.6. Hình ảnh cuống sinh bào tử bề mặt bào tử của một số 35


1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 4
 4
 5
 6
1.3. Sơ lược về cellulose 7
 7
 8
 9
1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase 12
 12

 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG , PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 15
2.1. Vật liệu và vi sinh vật 15
 15
 15
2.2. Môi trường 15
x 15
2.2.2. Môi tr: 7,2) 17
2.2.3. Môi trenzyme 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Ph 18
 18
 19
 19
 20
2.3.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
3.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Minh Trí, Sóc Sơn,
Hà Nội 22

liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên
cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam
hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả
năng sản xuất enzyme nhất là cellulose từ tự nhiên không những giúp tận
dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn
gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một
thời gian sử dụng.
Trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải có khả
năng phân giải celluloza cư trú ở trong đất như vi khuẩn, xạ khuẩn , nấm mốc,
niêm vi khuẩn. Đáng chú ý nhất là xạ khuẩn. Chúng phân bố rộng rãi trong
đất, tham gia vào nhiều quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ: cenluloza,
tinh bột…góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Xuất
2

phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài: 
cellulase trong   .
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh
cellulase cao trong đất ruộng tại khu vực Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội nhằm
ứng dụng vào việc xử lý rác thải.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Minh
Trí, Sóc Sơn, Hà Nội.
3.2. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1ng: Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất
trồng trọt
4.2. Phm vi nghiên cu: tại khu vực Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội từ tháng
tháng 4/2013 đến tháng 4/2014

giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân loại năm giới hay bảy giới thì xạ
khuẩn đều thuộc giới vi nấm chuẩn (Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ. Bộ xạ
khuẩn gồm 10 họ trong đó Streptomycetaceae là loại xạ khuẩn có hệ sợi giống
nấm, đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy rất nhiều hợp chất hữu cơ
bằng emzym ngoại bào [15].
 khun
m hình thái và tính cht nuôi cy
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ
khuẩn làm 4 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân
hóa thành HSKS, HSCC.
4

Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông
góc với nhau tạo thành cấu trúc tương tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có
hình chữ T, V và thường không có hệ sợi.
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
m hình thái ca x khun
Tùy loại môi trường mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi
trường nuôi cấy mà kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như đỏ,
da cam, hồng, vàng, nâu, xám Khuẩn lạc xạ khuẩn có thường chắc, xù xì,
dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và có cấu trúc 3 lớp: lớp ngoài có cấu trúc
sợi bện chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc
tương đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn có hướng sinh trưởng trong môi
trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Đường kính hệ
sợi xạ khuẩn thay đổi theo trong khoảng 0,02 - 0,1 μm đến 2 - 3 μm. Đa số
các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ

các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella
Nhóm 3 (Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora
Nhóm 4 (Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đường
araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium
Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau
nhưng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn
ngang. Giống như vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân.
Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram
+
. Màng tế bào chất
dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn.
6

Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng
nhân. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thế sau đó hình thành
nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin) [7].
m ca chi x khun Streptomyces
Chi Streptomyces có số lượng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,
HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính
khuẩn lạc từ 1- 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề
mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi
khi không thấm nước. Chuỗi bào tử được tạo thành trên cuống sinh bào tử,
chúng có thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có
thể lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau,
sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo tế bàocủa vi khuẩn Gram
+
, là
vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 25 - 30

khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty
[1], [4], [10].
1.3. Sơ lƣợc về cellulose
1.3.1. 
Cellulose có công thức: C
6
H
10
O
5
( n= 5000- 10000) – là loại polyxacarit
chủ yếu trong xác thực vật, chiếm tới 50- 80% lượng chất khô. Cellulose
chiếm một nửa toàn bộ cacbon hữu cơ của sinh quyển. Hợp chất cao phân tử
này cấu tạo bởi hàng trăm, hàng nghìn gốc β – D- glucoz, có cấu trúc không
gian như sau:

Liên kết trong phân tử cellulose gồm các liên kết β – 1.4 – glucozit và
liên kết H
2
giữa 2 gốc β – D- glucozo kế tiếp nhau. Các phân tử β - D - glucoz
có cấu trúc ghế bành, 2 phân tử gần nhau quay góc với nhau 180◦. Vì thế,
phân tử xenluloza có cấu trúc mạnh thẳng, không phân nhánh, tạo thành một
sợi dài. Các sợi liên kết với nhau thành sợi nhỏ có đường kính 10- 40 nm gọi
8

là vi sợi. Các vi sợi liên kết với nhau bởi phân tử heemicellulose và lignhin
tạo nên độ cứng cho cấu trúc thành tế bào thực vật.
Chính kiểu cấu trúc trên mà cellulose rất bền , dai và chắc. Cellulose
không tan trong bất kì dung môi nào ( trừ dung dịch Schweitzer - Dung dịch
Amoni của muối đồng). Phân tử cellulose bền vững và mềm dẻo, do dó màng

se
Nguồn cơ chất để cellulase phân giải là vô cùng phong phú và đa dạng
trong tự nhiên cũng như trong đời sống sinh hoạt.
Hàng ngày, một lượng lớn chất thải lignocellulose từ nông nghiệp, công
nghiệp, đô thị luôn chồng chất hoặc sử dụng chúng một cách kém hiệu quả do
giá thành của quy trình sử lý rác thải rất cao. Điều này trở thành vấn đề quan
trọng hàng đầu với sinh thái, công nghiệp hóa học và công nghệ sinh học.
Hơn nữa, đây còn là vấn đề kinh tế đáng quan tâm trong việc phát triển quy
trình tái sử dụng cho hiệu quả và lợi dụng chất thải cellulose như là nguồn cơ
chất rẻ tiền. Cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng
cellulase cho mục đích chính:
Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghệ thực
phẩm bổ sung và thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường. Thủy phân
cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau.
Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:
Công n: Cải thiện chế độ tiêu hóa thức ăn, chiết rút
các chất gây vị, dầu, dịch ép protin từ rau quả, cải thiện độ hòa tan của các
nguyên liệu trong công nghệ lên men, sản xuất rượu và một số axit hữu cơ
Công : Cải thiện độ tiêu hóa rơm, cỏ làm thức ăn gia súc, sản
xuất thức ăn giàu protein
10

: Ứng dụng trong xử lý phế liệu sau thu hoạch, xử lý
rác đô thị, phân hủy thành phân bón hữu cơ, phân hủy các chất tồn lưu, trong
đó có DDT, TNT.
: Cung cấp cơ chất cho tổng hợp khí metan, glyxerin, axit
xitric, axit lactic, vitamin, protein đơn bào, chất kháng sinh, các chất có hoạt
tính sinh học khác.
Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối cellulose sản xuất ra

hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông
nghiệp.

Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức
cao nhất. Trong nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ
sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các
enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của
thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme
này mà thường bổ sung với các enzyme khác như: amylase, protease,
xylanase tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme (multienzyme).
Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ
chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.
Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hóa của chúng chưa
hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn
nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6 ÷ 14%.
Thí nghiệm trên lợn 1 ÷ 3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8 ÷ 40%, tăng khả năng
sử dụng thức ăn từ 10 ÷ 18% [10].
12

Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá
trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đấy. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase đều thu được
kết quả tốt, khả năng tăng trọng của trâu bò có thể đạt tới 12 ÷ 17 %, có khi
còn cao hơn [12].
Trên thế giới, người ta sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu

hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn. Vì vậy trê thế giới và Việt
Nam đã có những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của các vi sinh vật
trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp. Đặc biệt xạ
khuẩn là một loài vi sinh vật có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể
cho nguồn enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến ức ăn gia
súc probiotin
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về xạ khuẩn và khả năng sinh cellulase
của nó vẫn còn khá mới. Đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong
thức ăn chăn nuôi nhưng đối tượng nghiên cứu chủ yếu lại là nấm mốc, nấm
men như: Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng
Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho
trâu, bò. Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã ứng dụng các chủng nấm
men trong bã thải sinh hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc. Đặng Minh
Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng
sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, (2006). Những nghiên cứu này chủ
yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của
một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển
chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh
14

tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ
chủng Penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007).
Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa
nhiệt XKS
2
(Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Tuy nhiên Việt nam là
đất nước sản xuất nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả năng
sinh enzyme cellulase của xạ khuẩn có triển vọng rất lớn. Vì thế việc
“             
   là rất cần thiết nhằm thu

4
, NaCl, NH
4
Cl , (NH
4
)
2
SO
4
, CaCO
3
, saccarose các hóa chất
thông dụng khác.
2.1.2.2.  : Tủ ấm, tủ sấy Binder, Nồi hấp (TOMY- Nhật ), máy lắc,
máy li tâm (Shorwall super T21 – Mỹ ), cân điện tử (Presica XT 320M –
Thụy Sĩ ), kính hiển vi quang học, các dụng cụ khác trong Phòng thí nghiệm
vi sinh vật khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2. Môi trƣờng
x
Môi trường Czapeck- tinh bột
Hóa chất
Gam
Tinh bột tan
20
KCl
0,5
NaNO
3
3
MgSO

KCl
0,5
NaNO
3
3
MgSO
4
.7
.
H
2
O
0,5
K
2
HPO
4

1
CaCO
3

3
FeSO
4
(dạng vết)
0,01
Thạch Agar
20
Nước cất

4
(dạng vết)
0,01
Thạch Agar
20
pH
7,2
2.2.2. Môi tr: 7,2)
Môi trường Gause I: như mục 2.2.1