SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Vitamin C (Vit.C) hay còn gọi là axit L-ascobic là một trong những loại
hợp chất quan trọng đối với sự sống của con người.
Vit.C đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ
thể người, nó tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều tiết quá trình sinh tổng
hợp hoormon, là chất đề kháng cho cơ thể sinh vật, chất chống lão hóa các tế
bào...Thiếu Vit.C sẽ gây ra một số bệnh nguy hiểm có thể dẫn đến tử vong.
Vit.C còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với
vai trò là chất chống oxi hóa. Nó giúp cho các sản phẩm giữ được sự tươi
ngon trong quá trình bảo quản. Nhiều loại hàng hóa trên thị trường như nước
giải khát, nước ép trái cây đóng hộp, bột dinh dưỡng cho trẻ em...chứa Vit.C
nhằm duy trì chất lượng cũng như là một tiêu chí quảng cáo sản phẩm.
Các loại rau xanh và hoa quả là những nguồn cung cấp Vit.C tự nhiên,
rất tốt cho sức khỏe. Ngoài ra Vit.C cũng được tổng hợp theo con đường nhân
tạo, đáp ứng nhu cầu cao về vitamin của cơ thể người cũng như của các ngành
công nghiệp có liên quan.
Tuy nhiên Vit.C là một chất rất dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ
và ánh sáng bình thường. Do đó việc xác định nó trong các đối tượng trên một
cách chính xác, nhanh chóng là một yêu cầu hàng đầu được đặt ra. Ở Việt
Nam, phương pháp xác định Vit.C trong các phòng thí nghiệm chủ yếu vẫn là
phương pháp chuẩn độ thể tích, có độ chính xác và độ nhạy không cao. Theo
nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các
phương pháp điện hóa đặc biệt là phương pháp von-ampe. Đây là một trong
những phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt được độ chính

1


(R)-3,4-đyhdroxy-5-((S)-1,2-dihydroxylethyl)furan-2(5H)-one.
Công thức phân tử

C6H8O6

Khối lượng phân tử

176,1

Nhiệt độ nóng chảy

1930C

Công thức cấu tạo
6

CH2OH
5

OH
O

1

O

4
3

HO

chua, nóng chảy ở 1930C. Axit ascobic dễ tan trong nước, ít tan hơn trong
rượu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực.
Axit ascobic rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ vì
vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp.
1.1.2.Tính chất hóa học
a, Tính khử
Axit ascobic là chất khử mạnh, có bán phản ứng như sau:
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O

O

O


HO

+ 2H+ + 2e–

OH

O

+ 1/2 O2
HO

OH

+ H2O
O

4

O


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Sản phẩm tạo ra là axit L- đehiđroascobic, chất này cũng có hoạt tính
sinh học tương tự như axit L-ascobic, nhưng không bền, nó dễ bị thủy phân
phá vòng tạo axit 2,3-đixetogulonic CH2OH–(CHOH)2–CO–CO–COOH, là
chất không có tác dụng sinh lý.
Tốc độ oxi hóa axit ascobic thành axit L-đehiđroascobic càng lớn khi
PH càng tăng. Các chất saccarozơ, carotenoit, flavonoit...có khả năng làm
chậm quá trình oxi hóa của axit ascobic nên được dùng làm chất ổn định hóa
Vit.C.
Cơ chế sự phân hủy của axit ascobic bởi chất oxi hóa có thể được biểu
diễn theo sơ đồ sau:

5


OH

HO

COOH
COOH
H2O
CHO

OH
HO

O

O

OH
HO

CH2OH

Axit L-ascobic

Axit L-đehiđroascobic

CHO

COOH

OH


CH2OH

COOH

CH2OH

[O]

C O

[O]

CH2OH
C O
CH2OH

HO
CH2OH

[O]

CH2OH

CH2OH

[O]

C O



b, Tính axit
Trong dung dịch nước axit ascobic là một axit yếu ở nấc 1, pKa,1 = 4,2
tưong ứng với quá trình phân ly H+ của nhóm OH đính vào C3 (*), và rất yếu
ở nấc 2, pKa,2 = 11,6 tương ứng với sự phân ly H+ của nhóm OH đính vào C2
(*).
Axit ascobic dễ dàng phản ứng với dung dịch bazơ mạnh như NaOH,
KOH, Ca(OH)2 tạo muối.
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O



O + NaOH
OH

HO

O + H2O
O

O


Khóa luận tốt nghiệp

panmitic, axit stearic. Sản phẩm este dạng 6-O-axyl L-ascobic (ascobyl
panmitat, ascobyl stearat) có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu. Những este
này được tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế
biến. Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng được sử dụng là:
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O

R
O

O

OR

HO

CH2OCOR

OH

O

O

RO

2-O-ankyl axit ascobic

O

O

O

O

HO

OCOR

2-O-ankanoyl ascobat

ROCO

OH

3-O-ankanoyl ascobat

Trong đó, R là các gốc hiđrocacbon mạch dài, có thể no hoặc không no,
giúp cho các dẫn xuất của axit ascobic dễ tan trong dầu béo hơn.


[O]

OH

HO
H

HO

H

H

O

H

enzim

[H]

H

OH

OH

HO


H

COOH
COOH

CH2OH

CH2OH

enzim

CH2OH

[O]

OH

OH

O

O

OH

OH

H

H

H
HO

H

H2/Ni

H

H

H

OH

HO

HO

HO

H

C O

oxi hoa

H

HO

O

H

+2H2O,H+
-2CH3COCH3

[O]

O C

H3C
C
O H3C

H

H2C

CH3

O
H

10

O

H2C


C

+2CH3COCH3

OC

HO C

O C

H3C

CH2OH

D-Sobitol

OC

HO

OH

OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH


602 nm. Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không
màu.
C6H8O6 - 2H+ - 2e-

C6H6O6

C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e-

C12H9Cl2NO2

Người ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo
điện thế.
Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ
từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic
trong môi trường có PH thích hợp. Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có
sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên. Phương pháp này có thể
được áp dụng trực tiếp để xác định Vit.C trong dược phẩm. Tuy nhiên trong
các đối tượng khác như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất
khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn
cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ.
11


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Người ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất
chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp,
xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lượng dư dung dịch KBr vào

SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Các phương pháp công cụ có thể xác định Vit.C gồm các phương pháp
phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích điện hóa.
Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián
tiếp. Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín
hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy người ta thường dùng một tính chất
nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến
đổi tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C. Hay khi
dùng phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ
cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS. Người ta dùng một
ion kim loại mang tính oxi hóa (ví dụ Fe III) để tác dụng với Vit.C theo tỷ lệ
xác định. Việc xác định hàm lượng kim loại đó trên máy AAS là dễ dàng, từ
đó có thể tính ra hàm lượng Vit.C ban đầu. Nhóm các phương pháp điện hóa,
trong đó xác định Vit.C bằng phương pháp cực phổ, sử dụng điện cực giọt
thủy ngân, là trực tiếp dựa trên tính chất oxi hóa khử của Vit.C. Ngoài điện
cực giọt Hg, người ta còn dùng các điện cực biến tính, bằng cách tạo một lớp
màng có hoạt tính điện hóa với Vit.C trên bề mặt điện cực rắn.
Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách
cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương
pháp phân tích. Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc
ký lỏng cao áp (HPLC) kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA).

1.2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích quang học
Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong
suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản
ứng phát quang. Thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C.


hàm lượng của chúng gấp 200 lần lượng axit ascobic.
Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được
đường chuẩn tuyến tính đến hàm lượng Vit.C đến 5µg/mL (tương ứng 5ppm,
khoảng 3.10-5 mol/L), và giới hạn phát hiện tới 0,02µg/mL (20ppm, khoảng
10-7 mol/L). Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa
Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt.

14


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Chen, Xu-wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C
bằng phương pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detectơ đo quang.
Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất oxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh
ra tạo phức màu với 2,2’-đipiridin trong môi trường axit yếu (PH=5), kết quả
đo A ở max = 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng axit ascobic trong mẫu. Ưu điểm
của phương pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu
thuốc/giờ.
Trong khi đó, Yebra-Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm
chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm
lượng Mn(VII) còn dư, Mn(II) tạo ra sẽ được giữ trên lớp nhựa poly (axit
aminophotphoric) sẽ không gây ảnh hưởng đến kết quả xác định Mn(VII) dư.
Theo báo cáo cho biết thì giới hạn phát hiện chỉ khoảng 0,06 µg/mL (khoảng
60ppm, 3,5.10-4mol/L), tuy nhiên điều này không quan trọng lắm, vì hàm
lượng Vit.C trong mẫu phân tích thường lớn. Nhưng quy trình phân tích này
cho phép xác định tự động 90 mẫu/h, có khả năng ứng dụng trong các phòng
phân tích của các nhà máy.

•

Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampe

SP: nguồn điện

SW: cầu chia thế

W: điện cực làm việc

R: điện cực so sánh

A: điện cực phù trợ

V: vôn kế

i: điện kế

16


SVTH: Lê Thị Thu Huyền
•

Khóa luận tốt nghiệp

Điện cực làm việc:
Phương pháp phân tích von-ampe sử dụng điện cực giọt Hg, hay dùng

là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh

phản ứng điện cực.
- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van
khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi
phân tích.
- Kích thước giọt nhỏ nên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không
đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử
trên điện cực thực tế là không xảy ra.
•

Điện cực so sánh:
Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa.

Điện cực so sánh phải có thế ổn định.
•

Sóng cực phổ khuyếch tán:
- Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại i d tỷ lệ tuyến

tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id =f(C), người ta lợi dụng
tính chất này để phân tích định lượng. Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điện có độ
phân giải không cao cũng như có dòng dư lớn. Do đó hạn chế độ nhạy của
phương pháp chỉ xác định được 10-5M, và khả năng xác định nhiều chất cùng
trong một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém. (Hình 1.2)
- Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được
nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều. Có thể kể đến
+ Cực phổ sóng vuông (SqW)
+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)
+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)
+ Các phương pháp von ampe trên điện cực đĩa quay


Phương pháp phân tích điện hóa được dùng chủ yếu là phương pháp
von-ampe. Trong đó việc sử dụng điện cực thủy ngân đặc biệt là có sự hỗ trợ
của thiết bị điện tử, kết nối với máy vi tính, tăng độ nhạy và độ chính xác của
phép phân tích lên rất nhiều, đồng thời quy trình cho phép phân tích nhanh,
không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh được sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa của
không khí.
Trước năm 1950, phương pháp cực phổ cổ điển đã được áp dụng xác
địmh hàm lượng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả. Nhiều công trình
nghiên cứu đã tìm được điều kiện thích hợp cho phép xác định Vit.C. Tuy
nhiên do giới hạn của phương pháp cực phổ cổ điển, mà việc định lượng

19


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Vit.C vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit
ascobic. Các hợp chất sunfuhydryl thường có mặt trong các mô thực vật là
một trong số đó. Vì vậy đối tượng phân tích còn hạn chế.
Gần đây, các kĩ thuật quét thế, và ghi dòng được hỗ trợ bởi các thiết bị
điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở
các phòng thí nghiệm. Những nhược điểm đó được khắc phục, nhưng không
nhiều công trình nghiên cứu xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực giọt thủy
ngân mà một số nghiên cứu đi theo hướng chế tạo điện cực biến tính, điện cực
sinh học. Chủ yếu là tạo màng sinh học, hay màng polime, các loại màng
được chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic.
Sự xuất hiện của ion Cu2+ có mặt trong các enzym trong vỏ quả dưa
chuột, và các loại quả khác, cũng như các ion Cu2+, Ni2+ được tạo ra trên bề

dioxan 1:9, TBAOHO 1M, còn thế của Vit.C là +0,23V trong nền axetat
0,05M pH=3, NaNO3 0,01M. Thêm nữa, dùng kỹ thuật xung vi phân (DDP),
giúp cho việc xác định vị trí và chiều cao pic của Vit.C một cách rõ ràng và
chính xác. Điều này có nghĩa là có khả năng xác định trực tiếp Vit.C trên điện
cực giọt Hg mà không cần xử lý mẫu để loại những chất nền ảnh hưởng đến
bản chất hóa học của phương pháp. Quy trình nhanh, chính xác, khả năng
phân tích hàng loạt là có thể đạt được. Vì vậy tôi chọn sử dụng điện cực giọt
Hg treo trong phân tích Vit.C.

1.2.2.2.3. Phƣơng pháp cực phổ xung vi phân
Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa
hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục
được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp
xung thường.
Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một
điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm. Ghi dòng tại hai thời
điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung. Đường biểu diễn sự khác
nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định, có độ
21


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

phân giải cao. Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư,
một hạn chế của cực phổ cổ điện (hình 1.2)
Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông
số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:
i = nFSC (D/  tx)1/2 P (  2 – 1)/[(  +P)(1+P  )]

(1.5)

Bán chiều rộng của píc được xác định bởi công thức:

22


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

W1/2 = 2RT/(nF) cosh-1[2 + cosh(nF∆E/(2RT))]

(1.6)

Do vậy khi tăng biên độ xung thì theo phương trình (1.4) dòng i tăng
lên, nhưng đồng thời bán chiều rộng píc cũng tăng theo (1.6), do đó giảm độ
phân giải của phương pháp. Trong trường hợp biên độ xung đủ nhỏ thì bán
chiều rộng được tính bởi công thức (1.7)
W1/2 = 3,52 RT/(nF) = 90/n mV ở 250C

(1.7)

Vì vậy để đạt được giá trị dòng lớn đồng thời W1/2 đủ nhỏ, thường đặt
biên độ xung khoảng từ 10 đến 100 mV.

Hình 1.2 so sánh sự giống và khác nhau về kĩ thuật biến đổi thế và kĩ
thuật ghi dòng giữa các phương pháp cực phổ cổ điển (DC), cực phổ xung
thường (NP) và cực phổ xung vi phân (DP). Thấy rõ ưu điểm của phương
pháp von-ampe từ việc phân tích sóng cực phổ có dạng píc là tăng độ nhạy,


Chƣơng II: THỰC NGHIỆM
2.1. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Dụng cụ:
Các dụng cụ thủy tinh, buret, pipet, bình định mức của Đức có độ chính
xác cao, được ngâm rửa thường xuyên bằng hỗn hợp kali đicromat và axit
sunfuric đặc 98%.
2.1.2. Thiết bị, máy móc
•

Máy phân tích điện hóa đa chức năng 757VA Computrace,

Metrohm.
- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg
- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl
- Điện cực phù trợ: điện cực Pt
• Máy pH meter Precisa 900, Thụy Sĩ
• Cân phân tích STARTORIUS ( độ chính xác  0,2 mg).
• Xử lý số liệu trên máy tính, dùng chương trình Excel.
2.1.3. Hóa chất
• Axit ascobic ( North general pharmaceutical factory China )
• Axit axetic băng
• Natri axetat, natri clorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O
• Axit pecloric, axit oxalic, axit tactric, axit citric
Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA).

25