1
Li cm n

Trc ht em xin chõn thnh gi li cm n n Phũng bnh hc
phõn t - Vin di truyn nụng nghip cựng cỏc cỏn b cụng nhõn viờn
trong phũng ó to iu kin giỳp em trong sut thi gian thc tp
va qua.
Em cng xin gi li cm n n Vin Cụng ngh Sinh hc Thc
phm - i hc Bỏch Khoa H Ni v cụ giỏo hng dn to iu
kin cho em hon thnh t thc tp k thut.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

2
Li m u

Vin Di truyn nụng nghip c thnh lp ngy 10/10/1989, tin thõn
ca Vin l Trung tõm Di truyn Nụng nghip (thnh lp nm 1984). Hin nay,
Vin nm trờn a bn huyn T Liờm, H Ni.
Chc nng chớnh ca Vin l :
-Nghiờn cu, ng dỳng cỏc phng phỏp di truyn hc hin i v cụng
ngh sinh hc chn to cỏc ging cõy trng cú nng sut cao, phm cht tt,
chng chu sõu bnh v cỏc iu kin bt li ca mụt trng.
-To cỏc chng vi sinh vt mi phc v bo qun v ch bin lng thc-
thc phm, sn xut cỏc loi ch phm sinh hc phc v nn nụng nghip bn
vng v bo v mụi trng.
-Tng cng hp tỏc quc t v tham gia o to cỏn b v lnh v Di
truyn v Cụng ngh sinh hc.
thc hin c cỏc chc nng trờn, Vin ó t chc thnh 10 n v
nghiờn cu v chuyn giao cụng ngh vi tng s cỏn b l 116 ngi trong ú
cú 3 tin s , 6 phú giỏo s, 16 phú tin s v 8 thc s.

chết và cây trồng trở nên bị bệnh.
Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn chưa biểu hiện ra
nhưng chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh
bắt đầu thay đổi và biểu hiện ra ngồi các triệu chứng bệnh mà mắt thường có
thể thấy được. Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm
nhiễm của vi sinh vật hay ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường bất lợi mà
chúng ta có thể biết được mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể được
định nghĩa là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mơ thực vật với
các vi sinh vật gây bệnh hoặc với các yếu tố mơi trường mà ta có thể nhìn thấy
được hoặc khơng nhìn thấy được, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng,
chức năng, hoặc tình trạng ngun vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy
yếu hoặc có thể gây chết tồn phần hoặc từng phần của cây.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

4
Cỏc tỏc nhõn gõy bnh vi sinh vt thng gõy bnh bng cỏch can thip
vo quỏ trỡnh trao i cht ca t bo cõy thụng qua cỏc enzyme, cỏc cht c t,
cỏc cht iu ho sinh trng v cỏc loi cht khỏc m chỳng tit ra khi tip xỳc
vi cõy ch, hoc hp th dinh dng ca t bo ch phc v cho mc ớch s
dng ca chỳng. Mt s sinh vt khỏc li gõy bnh bng cỏch sng ký sinh v
phỏt trin, sinh sn trong h thng bú mch mụ g hay bú mch libe v hu qu
tt yu l lm tc nghn ng vn chuyn lờn xung ca nc v ca ng.
Ngoi ra, cỏc yu t mụi trng cng gõy bnh trờn thc vt khi tỏc ng vi
mc ngoi ngng chng chu ca cõy.
Cú rt nhiu loi bnh hi cõy trng, chỳng c phõn nhúm theo rt
nhiu tiờu chun: theo triu chng bnh, theo b phn cõy b bnh, theo loi cõy
b bnh ... Hin nay, ph bin nht l ngi ta phõn loi bnh cõy da vo loi
tỏc nhõn gõy bnh. Theo tiờu chun ny, bnh thc vt c chia lm 2 loi:
bnh gõy ra do cỏc yu t sinh hc v bnh gõy ra bi cỏc yu t khụng sinh hc.
Theo tiờu chun ny, ta cú th ch ra c nguyờn nhõn gõy bnh, quỏ trỡnh tin

vật chất thơng tin di truyền. Khi tạo được mơi trường ni cấy phù hợp, sử dụng
các chất điều khiển sinh trưởng thực vật, ta có thể hoạt hố gen cần thiết để bắt
một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển được thành cây hồn chỉnh.
Phân hố và phản phân hố của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của cơng
nghệ này. Trong đó, sự phân hố là việc chuyển những tế bào phơi sinh trở
thành các tế bào chun hố để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý,
sinh hố; còn sự phản phân hố là sự chuyển các tế bào đã chun hố trở lại
trạng thái phơi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới.
Điều kiện để tế bào thể hiện tính tồn năng qua con đường phân hố và
phản phân hố là mơi trường ni cấy.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

6

II.Mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật:

Mơi trường ni cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành cơng
của việc ni cấy mơ tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm:

1. Ngun tố khống đa lượng: Là các ngun tố như N, P, K, Mg, S,
Ca...,chiếm nhiều trong mơi trường ni cấy với hàm lượng của mỗi
ngun tố thường lớn hơn 30mg/l. Chúng là ngun liệu để tế bào, mơ
thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc.
2. Các ngun tố khống vi lượng: Là các ngun tố như Fe, Mn, Mo, B, I,
Cu, Zn, Co... với hàm lượng mỗi ngun tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là
thành phần của coenzim để xúc tác phản ứng hố sinh diễn ra trong tế bào
sống.
3. Nguồn cacbon: Trong ni cấy mơ, tế bào thực vật, các mơ và tế bào
chuyển sang phương thức sống dị dưỡng nên cần phải cung cấp cho chúng
một nguồn cacbon hữu cơ, thường là đường mía saccaroza (trong một số

tế bào và mơ thực vật tách rời. Người ta thường sử dụng chủ yếu hai
nhóm chất điều khiển sinh trưởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích q trình tăng trưởng của tế bào, kích thích
sự hình thành mơ sẹo và rễ bất định. Các loại thường dùng là
IAA(axit indolaxetic), ỏNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic)....Hàm lượng
dùng nhỏ 10
-5
-10
-7
mol/l.
- Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định.
Các loại thường dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin),
Zeatin, TDZ(Thidiazuron)....với hàm lượng 10
-5
-10
-7
mol/l.
Người ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lượng
phù hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tương đối: tỷ lệ auxin
trên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì
mẫu cấy tạo mơ sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi.
Ngồi ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ
nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tưởng chiều dài thực vật,
sử dụng nhiều trong ni cấy mơ phân sinh; các hợp chất ức chế sinh
trưởng: axit absisic (ABA), CCC… sử dụng trong bảo quản nguồn
gen invitro.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

8


Bc 1: Nuụi cy khi ng
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

9
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu ni cấy. Mẫu ni cấy thường
sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngồi ra,
tuỳ thuộc từng đối tượng ni cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu ni cấy
như mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phơi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu
sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp
sát trùng bề mặt bằng chất hố học, thường là HgCl
2
0,1% sát trùng trong 5-10
phút. ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit như NaOCl, Ca(OCl)
2
5%
trong 20-30 phút. Ngồi ra còn dùng H
2
O
2
15%,dung dịch Brom 5-10% nhưng
hiệu quả khơng cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào mơi trường thích hợp
để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phơi vơ tính. Việc lựa chọn mơi trường
thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất
điều khiển sinh trưởng trong mơi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được
hình thái.

Bước 2: Nhân nhanh mẫu

có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới
đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ
chăm sóc bình thường.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc ni cấy mơ tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật ni cấy mơ để nhân giống vơ tính, có xảy
ra hiện tượng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh
lí, sinh hố, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai
đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mơ non ít chun hố để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh
trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời,
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

11
phi hn ch s ln cy chuyn khi nhõn nhanh (5-6 ln), gim
s tớch lu, gia tng nh hng ca cỏc chỏt iu khin sinh trng.
- S nhim mu cy
+ Cú mt s vi sinh vt cú kh nng xõm nhp v tn ti rt sõu
trong h thng mụ dn ca thc vt. Khi t bo thc vt bt u
phỏt trin, phõn chia, chỳng lm nhim mu vo mụi trng sau 2-3
tun nuụi cy.
+ Khc phc: Chn v nuụi trng cõy m ỳng tiờu chun, nu cõy
m b bnh cú th dựng khỏng sinh kh trựng mu
- S tit c t t mu cy
+ Sau 1-2 ngy a vo mụi trng, mu cy tit ra nhng cht
mu en, nõu lm hng mụi trng, cht mu. Cỏc cht ú cú th l
tanin, polyphenol b oxy hoỏ.
+ Khc phc: Chn mu non gim hm lng tanin, polyphenol ;

cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật ni cấy mơ tế bào, người ta có thể tạo ra được
hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, khơng tốn diện tích
cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất lợi.
Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống
bằng con đường hữu tính, các giống q hiếm có số lượng giống ban đầu hạn
chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng ni cấy mơ trong cả nước đã được
thành lập và cho đến nay đã thu được một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-
Trung tâm Khoa học và Cơng nghệ Quốc gia đã hồn thiện quy trình nhân giống
in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai
lang, dứa sợi... Tại trường Đại học Nơng nghiệp I Hà Nội đã hồn thiện quy
trình nhân giống khoai tây chất lượng cao, bước đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh
phía Nam đã xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hồn
thiện quy trình nhân giống cây cao su . Ngồi ra, các phòng thí nghiệm ni cấy
mơ tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành cơng nhiều quy trình nhân giống
cây hoa, cây ăn quả, cây rừng, cây q hiếm...có giá trị cao.
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

13
Tóm lại, ni cấy mơ tế bào thực vật hiện nay được đưa vào trong các
chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý
luận sinh học cây trồng, vào thực tiễn nơng nghiệp, mở ra một hướng đi mới cho
nghiên cứu di truyền học, hố sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những
ứng dụng to lớn trong cơng tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng. V.Kết quả và thảo luận
Thực hiện ni cấy mơ đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vườn của
viện Di truyền nơng nghiệp.
- Mẫu cây được cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm.

m bo an ninh lng thc ng thi phỏt trin nhanh nn kinh t,
trong nhng nm gn õy Vit Nam ó nhp nhiu ging cõy trng v hoa cõy
cnh t nhiu quc gia trờn th gii. iu ny luụn kốm theo cỏc nguy c xõn
nhp ca vi sinh vt gõy hi, c bit l cỏc bnh hi thc vt thuc din KDTV
Vit Nam.
Trờn th gii cng nh Vit Nam, bnh hai thc vt gõy nờn nhng thit
hi vụ cựng to ln v chỳng ang lm nh hng ỏng k n cht lng sn
phm cng nh nng sut cõy trng. c bit l bnh hi do virus gõy ra: Virus
PVY l virus gõy bnh thi c khoai tõy, lm gim nng sut c ti 80%, nú
cng gõy thit hi ỏng k trờn cõy c chua, t, thuc lỏ. Khi thuc lỏ b nhim
virus ny thỡ nng sut gim ti 30%. Trong lnh vc hoa cõy cnh cũn trm
trng hn. Vic ỏp dng nhng thnh tu khoa hc k thut ca CNSH, c bit
l sinh hc phõn t v Min dch liờn kt gn enzim vo sn xut l rt cn thit
nhm tng nng sut cõy trng, chn oỏn nhanh v chớnh xỏc tỏc nhõn hi cõy
trng, ỏp ng c ũi hi cp bỏch ca KDTV.
Mt s tỏc nhõn gõy bnh thng thy trờn c chua, khoai tõy, thuc lỏ.
Virus khm da chut Cucumber Mosaic Viruses (CMV)
Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v bin dng lỏ khỏc nhau, in hỡnh
nht l dng bin dng hỡnh kim, gõy nờn nhng thit hi nghiờm trng
trong sn xut c chua v thuc lỏ. Virus ny c lan truyn qua Aphis
gossyphii. Nú thuc nhúm Cucumovirus cú cu trỳc ARN mch n. Xut
hin dch bnh khụng cú quy lut bỏo trc.
Virus khm thuc lỏ - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v phng lỏ khỏc nhau, in hỡnh nht
l dng khm san hụ gõy nờn nhng thit hi nghờim trng trong sn xut
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

16
cà chua, gây ảnh hưởng đến chất lượng thuốc lá. Virus này được lan truyền
bằng con đường cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyền