BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SO SÁNH KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ CỦA NẤM XANH
Metarhizium anisopliae SOROKIN TRÊN NỀN CƠ CHẤT
GẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC NĂM CHỦNG NẤM
XANH CỦA HUNGARY VÀ MỘT CHỦNG VIỆT NAM
LÊN SÙNG KHOAI LANG
Cylas formicarius FABRICIUS
TRONG ĐIỀU KIỆN PHÕNG THÍ NGHIỆM

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGs. Ts. TRẦN VĂN HAI

HỒ NHẬT MINH

Ths. TRỊNH THỊ XUÂN

MSSV: 3073306

Cần Thơ – 2012

i


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài: “So
sánh khả năng tăng sinh bào tử của nấm xanh Metarhizium anisopliae trên nền cơ
chất gạo và đánh giá hiệu lực của năm chủng nấm xanh của Hungary và một
chủng của Việt Nam lên sùng khoai lang Cylas formicarius Fab.”.
Do sinh viên HỒ NHẬT MINH thực hiện và bảo vệ trước hội đồng
ngày tháng

năm

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức ...........................
Ý kiến hội đồng:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày tháng
DUYỆT KHOA

năm

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CHỦ NHIỆM KHOA NN & SHƢD

iii


LƢỢC SỬ CÁ NHÂN
------- o O o ------

HỒ NHẬT MINH

v


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………….1
CHƢƠNG 1. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU……………………………………………..3
1.1. Nấm xanh Metarhizium anisopliae...........................................................................3
1.1.1. Phân loại, hình thái học và lịch sử nghiên cứu.......................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm xanh Metarhizium anisopliae....................................4
1.1.3. Quy trình xâm nhiễm của nấm M. anisopliae........................................................5
1.1.4. Độc tố diệt côn trùng của nấm xanh.......................................................................7
1.1.5. Nhu cầu về dinh dưỡng........................................................................................10
1.1.6. Ảnh hưởng của những tác nhân phi sinh học.......................................................10
1.1.7. Tình hình ứng dụng nấm xanh.............................................................................11
1.2. Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius).....................................................12
1.2.1. Phân loại và ký chủ..............................................................................................12
1.2.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................13
1.2.3. Tập quán sinh sống..............................................................................................14
1.2.4. Gây hại.................................................................................................................15
CHƢƠNG 2.PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP...............................................16
2.1. Phương tiện.............................................................................................................16
2.2. Phương pháp...........................................................................................................17
2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự hình thành và phát triển bào tử của nấm Metarhizium
anisopliae trong môi trường gạo với các phương pháp sản xuất khác nhau..................17

vi




Hình 1.2

Thành trùng sùng khoai lang

13

Hình 1.3
Hình 3.1

Trứng, ấu trùng, nhộng, thành trùng sùng khoai lang và vị trí cư
trú của sùng trên thân và củ khoai lang và ấu trùng sùng trên củ
khoai lang
Chuẩn bị các môi trường sản xuất nấm xanh

Hình 3.2

Nấm xanh phát triển trên các môi trường tại thời điểm 5 NSKC

30

Hình 3.3

Kim tiêm và dung dịch huyền phù nấm xanh

31

Hình 3.4

Chủng nấm vào môi trường bằng kim tiêm

Bảng 1.1

Phổ ký chủ của M. anisopliae

4

Bảng 2.1

Thành phần môi trường cơ chất của từng nghiệm thức

18

Bảng 3.1

Mật số bào tử nấm M. anisopliae trên các nền cơ chất được xử lý
khác nhau

22

Bảng 3.2. Mật số bào tử phát triển trên nền cơ chất gạo với dung dịch dầu ăn
khi được chủng bằng kim tiêm

24

Bảng 3.3. So sánh mật số bào tử giữa phương pháp chủng nấm truyền thống
và phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm

25

Bảng 3.4. Độ hữu biệu của các chủng nấm M. anisopliae lên sùng khoai lang


SKL

Sùng khoai lang

TN

Thí nghiệm

VN

Việt Nam

x


HỒ NHẬT MINH, 2012. “So sánh khả năng sinh bào tử của nấm xanh Metarhizium
anisopliae Sorokin trên nền cơ chất gạo và đánh giá hiệu lực năm chủng nấm xanh của
Hungary và một chủng Việt Nam lên sùng khoai lang Cylas formicarius Fabricius trong
điều kiện phòng thí nghiệm”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo Vệ Thực Vật, Khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.

TÓM LƢỢC
Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích (i) nghiên cứu và chọn cách áp dụng cơ chất phù
hợp trong sản xuất chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae được thực hiện trong phòng
thí nghiệm với các nghiệm thức nấu gạo với tỷ lệ 300ml nước + 20ml dầu ăn, gạo vởi tỷ lệ
150ml nước + 10ml dầu ăn, ngâm gạo với nước và ngâm gạo với nước có hòa tan 5% CaCO3
trong 45 phút vào tháng 2/2012 tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học NEDO, bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, (ii) so sánh tốc độ tăng sinh bào tử khi sản xuất chế phẩm giữa hai
phương pháp cấy truyền thống và phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm (iii) so sánh hiệu

lượng bào tử cũng như tối thiểu hóa chi phí sản xuất là một yêu cầu rất cần thiết.
Tại Hungary, có 5 chủng nấm M. anisopliae có hiệu quả cao chống lại côn trùng được
phân lập từ côn trùng gây hại trên rễ bắp và gửi về phòng thí nghiệm NEDO, là những
chủng nấm có tiềm năng trong ứng dụng phòng trừ sinh học ở Việt Nam đồng thời giúp
đa dạng hóa các tác nhân gây bệnh côn trùng, cho nên cần phải được tiến hành nghiên
cứu hiệu lực phòng trừ trên các loài côn trùng bản địa.
Vì vậy, đề tài “So sánh khả năng sinh bào tử của nấm xanh Metarhizium anisopliae
Sorokin trên nền cơ chất gạo và đánh giá hiệu lực năm chủng nấm xanh của Hungary và
một chủng Việt Nam lên sùng khoai lang Cylas formicarius Fabricius trong điều kiện
phòng thí nghiệm” nhằm để tìm ra một loại cơ chất hữu hiệu hơn trong công việc sản

1


xuất chế phẩm quy mô bán công nghiệp và so sánh chủng nấm M. anisopliae của Việt
Nam với 5 chủng nấm M. anisopliae từ Hungary.
Đề tài được thực hiện với mục đích chính như sau:
- Nghiên cứu môi trường thích hợp cho việc sản xuất chế phẩm nấm xanh M.
anisopliae thu được lượng bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn và khả năng duy trì
mật số bào tử cao.
- So sánh hiệu quả tăng sinh bào tử của chế phẩm nấm xanh bằng hai phương pháp
chủng nấm truyền thống và chủng nấm bằng kim tiêm.
- So sánh hiệu lực của 5 chủng nấm M. anisopliae từ Hungary và một chủng nấm M.
anisopliae bản địa trên sùng khoai lang Cylas formicarius Fabricius.

2


CHƢƠNG 1
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU


M. anisopliae lần đầu tiên được công bố bởi Metschnikoff năm 1879 dưới tên khoa học
là Entomophthora anisopliae và sau đó được đổi tên thành Metarhizium anisopliae bởi
Sorokin vào năm 1883. Sau một thời gian dài, dạng sinh sản hữu tính của giống
Metarhizium không được tìm thấy, do đó, M. anisopliae được phân loại vào ngành phụ
lớp nấm bất toàn Deuteromycota; lớp Hyphomycetes; bộ Hypocreales (Gisbert, 2007).
1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm xanh Metarhizium anisopliae
Sự hiện phân bố rộng lớn của M. anisopliae trên thế giới có nghĩa loài nấm này đã
được phân lập thường xuyên từ nhiều loài côn trùng (Gisbert, 1993). Veen (1968)
(trính dẫn từ Gisbert, 2007) đã đưa ra một danh sách ký chủ bao gồm hơn 200 loài côn
trùng ở bảy bộ khác nhau (bảng 1.1).
Mặc dù phổ ký chủ của M. anisopliae là rộng lớn, nhưng những dòng nấm đặc thù chỉ
có thể gây bệnh chỉ trên các loài côn trùng chuyên biệt (Augusto và Marilene, 2010).
Vài nhóm gene (genetic group) của M. anisopliae ở khu vực nhiệt đới hoặc cận nhiệt
đới, đặc biệt là các dòng nấm M. anisopliae var. majus, M. flavoviride và M. album cho
kết quả có hiệu quả chuyên biệt đối với côn trùng thuộc bộ Coleoptera, Orthoptera và
Hemiptera (Rombach et al. 1986; Bidochka & Small 2005).
Bảng 1.1. Phổ ký chủ của M. anisopliae (Veen, 1968).
Ký chủ của M. anisopliae
Orthoptera

11 loài

Dermaptera

1 loài

Hemiptera

21 loài

côn trùng (Fang et al., 2007). Tại đây, M. anisopliae tiết ra các lypase để phân hủy lớp
vỏ lipid này (Silva et al., 2005). Sự nẩy mầm sợi nấm và tiến trình xâm nhiễm thành
công tùy thuộc vào nhiều nhân tố như tính mẫn cảm của ký chủ đối với mầm bệnh,
điều kiện môi trường như nhiệt độ, ẩm độ phù hợp. Ngoài ra, những đặc tính như thành
phần sinh hóa kháng vi sinh ở các chuỗi acid béo, aldehydes, wax esters, ketones hoặc
alcohols của vỏ ngoài côn trùng cũng ảnh hưởng đến sự nẩy mầm bào tử. Tuy nhiên,
lớp vỏ ngoài côn trùng có thể có những đặc điểm sinh hóa đặc trưng giúp bào tử nấm
nhận diện, như các acid amin tự do hoặc các chuỗi peptides, và những yếu tố này giúp
kích hoạt quá trình tiếp xúc, nẩy mầm bào tử. Nhìn chung, sự nẩy mầm của M.
anisopliae diễn ra vào khoảng 20 giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc.
Bước 2: sự nẩy mầm sợi nấm và hình thành đĩa áp: trước khi xâm nhập vào cơ thể ký
chủ, bào tử nấm hình thành một đĩa áp. Quá trình này, nấm sẽ tiết ra các enzyme
proteases, chitinases và lipase để phân hủy các cấu trúc protein, chitin và lipid trên
phần vỏ ngoài ký chủ.
Bước 3: sợi nấm mọc xuyên qua lớp vỏ ngoài của côn trùng: sau khi phân hủy lớp vỏ
ngoài, sợi nấm bắt đầu mọc sâu vào phần cơ thể ký chủ, bắt đầu tiến trình xâm nhiễm.
5


Bước 4: chiến thắng các phản ứng miễn dịch của cơ thể côn trùng: khi tiến sâu vào cơ
thể ký chủ, nấm sẽ gặp phải các cơ chế tự phòng vệ do hệ miễn dịch của ký chủ tạo ra.
Theo Augusto Schrank và Marilene H.Vainstein (2010), nấm có hai cơ chế chính để
chiến thắng hệ miễn dịch của côn trùng: (1) phát triển một dạng sinh trưởng đánh lừa
sự nhận biết của hệ thống miễn dịch; (2) tiết ra các hợp chất để đàn áp hệ thống miễn
dịch (Wang và Leger, 2006).
Bước 5: lan toả trong cơ thể côn trùng bằng hyphal bodies hoặc blastospores: sau khi
xâm nhập thành công vào cơ thể ký chủ, nấm sẽ sản sinh ra các blastospores hoặc
hyphal bodies vào huyết dịch. Lúc này, M. anisopliae tiết ra một lượng lớn acid
trehalose, vì trehalose là loại đường chính trong huyết dịch côn trùng, M. anisopliae có
thể dùng đây làm nguồn dinh dưỡng và đồng thời làm giảm lượng dinh dưỡng cung

diệt côn trùng của nấm M. anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là destruxin A và
destruxin B, là một phức hợp có nhiều đồng phân, là sản phẩm thứ cấp depxipeptit.
Destruxin A có công thức nguyên tử là C29H47O7N5 có điểm sôi là 1880C. Destruxin B
có công thức cơ bản gồm nguyên tử là C30H50O7N5, có điểm sôi là 2340C. Cấu trúc cơ
bản gồm 5 aminoacid và một –hytroxy acid. Destuxin gây chán ăn, gây ngộ độc cho
côn trùng sau khi hấp thụ vào da (Amiri et al., 1999). Một số destruxin làm tê liệt côn
trùng (Dumas et al., 1996) và một số destruxin khác gây ức chế miễn dịch (Cerenius et
al., 1990). Từ những năm 1961-1962, Kodaira đã tách được một số destruxin A và
destruxin từ dịch nuôi cấy M. anisopliae. Trong khoảng thời gian từ năm 1965-1970,
Tamura và cộng sự đã tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có
chứa 0,5% pepton và từ 1 lít dịch nuôi cấy có thể nhận được từ 13-15 mg độc tố
destruxin A và B. Đến năm 1971 đã tổng hợp nhân tạo được destruxin B (trích dẫn bởi
Phạm Thị Thùy, 2004).
Năm 1981, Pais và cộng sự (Pais et al., 1981) đã xác định được 14 loại depsipeptiide từ
môi trường nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae. Trong đó có 5 loại đã được biết
trước đó là destruxin A, B, C, D, và desmethyldestruxin B. Cấu trúc của các hợp chất
mới được đặt tên là Destruxin E, A1, A2, B1, B2, C2, D1, D2 và E1. Các khác biệt
nằm ở chuỗi peptide, ví dụ như chứa pipecolic acid thay vì isoleucine. Trong khi
Strasser et al., (2000), Vey và et al., (2001) cho rằng có hơn 28 loại destruxin thuộc
các nhóm A (9), Nhóm B (10), nhóm C (3), nhóm D (3), nhóm E (7), nhóm F (1) và 1
nhóm mới (gồm 2 pseudodestruxin). Liu et al., (2004) cũng cho biết có hơn 35 loại
destruxin khác nhau đã được xác định đặc điểm.
Các loại destruxin có rất nhiều hoạt tính sinh học và các hoạt tính này đã được mô tả
chia tiết bởi Roberts (1989), Strasser et al., (2000), Vey et al., (2001), Pedras et al.,
(2002). Các hoạt tính quan trọng nhất của các loại destruxin:
(1)

Tác động lên côn trùng và có liên quan tới tính độc

(2)

nghiệm phun dịch trích destruxin chết hơn 70%,trong khi đó destruxin A được báo cáo
là có ít hoạt tính nhất đối với các loại côn trùng này. Trong các thí nghiệm khác nhau,
các tính chất làm côn trùng chán ăn khi dùng các loại destruxin A, B và E liều thấp
cũng được ghi nhận bởi Amiri et al.,(1999). Krasnoff et al.,(1996). Nguồn thức ăn là
lá bắp cải có phun destruxin A, B và E sẽ làm giảm tính ăn của ấu trùng Plutella
xylostella và Phaedon cochleariae một cách đáng kể. Cũng trích báo cáo này,
destruxin B được ghi nhận là không có hoạt tính ở nồng độ 400ppm.

9


1.1.5. Nhu cầu về dinh dƣỡng
Dinh dưỡng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, sinh bào tử và tính
hiệu quả của nấm M. anisopliae (Farooq et al., 2005). Khả năng gây bệnh và hiệu lực
của nấm có nguồn gốc từ một ký chủ chết tỏ ra hiệu quả so với các ký chủ mẫm cảm,
trong khi đó M. anisopliae được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo có thể làm giảm
tính độc của nấm (Butt, 2002). Tuy nhiên, để có thể thương mại hóa M. anisopliae, sản
xuất quy mô lớn đòi hỏi phải được thực hiện trên cơ chất nhân tạo (Farooq et al., 2005).
Farooq et al (2005) đã đưa ra môi trường phù hợp cho sự phát triển và tính độc của M.
anisopliae. Bào tử sản sinh nhiều nhất ở môi trường có tỉ lệ Carbon:Nitơ 35:1, giống
với môi trường SDA. Trong khi đó, nấm được nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh
dưỡng sẽ bị giảm tính độc hại. Theo Trần Văn Hai và cs., (2006) khi so sánh sự phát
triển của nấm trên các môi trường PDA, Czapek-Dox-Agar (CDA), SabouraudDextrose- Agar- Yeast (SDAY1) và Sabouraud-Dextrose-Agar-Yeast trộn với một số
vi chất (SDAY2) cho thấy môi trường SDAY 2 là môi trường thuận lợi nhất cho nấm
M. anisopliae phát triển.
1.1.6. Ảnh hƣởng của những tác nhân phi sinh học


Nhiệt độ.



Theo Tanada và Kaya (1993), Shah và Pell (2003); Phạm Thị Thùy (2004); thì trong số
các loài nấm đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng trong thực tiễn
nông nghiệp để diệt trừ sâu hại là các loài nấm thuộc ngành Deuteromycota (lớp
Hyphomycetes, bộ Moniliales gồm các giống: Beauveria, Metarhizium, Nomuraea,
Paecilomyces, Verticillium, Hirsutella, Aspergillus…)
Lotong và Suwanarit (1983) đã mô tả việc nuôi cấy nấm trong bọc poly propylene kích
thước 16 x 25 cm, chứa 10g cơm đã được chủng nấm Aspergillus flavus hoặc A. oryzae
được ủ ở 300C. Hiện tại có 2 nhà máy địa phương của Thái Lan đang sản xuất chế
phẩm nấm Metarhizium trong bọc nilon có kích thước 40 x 60 cm (Bartlett và Jaronski
được trích dẫn bởi Kunimi, 2005).
Năm 1990-1913, M. anisopliae còn được dùng để phòng trị ve sầu bọt, Tomaspis varia
tại Trinidad (Steinhaus, 1949), và rất hiệu quả để tiêu diệt kiến vương Oryctes
rhinoceros gây hại trên dừa (Friederichs, 1913 trính dẫn từ Zimmermann, 2007).


Trong nƣớc

Ở nước ta, bước đầu cũng đã nghiên cứu các loại nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ
sâu hại. Điển hình như ở Hưng Yên, năm 1993 đã sử dụng nấm xanh Metarhizium
11


anisopliae để phòng trừ sâu đo chỉ sau 7–10 ngày hiệu quả khoảng 70–89%. Tại Tây
Ninh và Hòa Bình, đã sử dụng nấm M. anisopliae và M. flavoviride của Viện Bảo Vệ
Thực Vật vào những năm 1993–1998 để phòng trừ và dập tắt dịch châu chấu đạt hiệu
quả từ 68,5 – 94% sau 2–6 tuần. Nấm xanh Metarhizium anisopliae đã được các cơ
quan, viện nghiên cứu nông nghiệp, trường đại học nghiên cứu ứng dụng và đã đạt
được những thành tựu to lớn. Điển hình như ở Thanh Hóa và Sơn La (1996–1998), tại
Bắc Giang (1998– 000), tại Hà Tĩnh (2003) đã sử dụng nấm trắng Beauveria bassiana

chủ yếu trên cây khoai lang và xuất hiện ở hầu hết các địa điểm tròng khoai lang
(Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).
1.2.2. Đặc điểm hình thái
Thành trùng dài từ 5-8mm, đầu đen, miệng dài, mắt kép lồi ra hai bên đầu. Râu đầi dài
có 10 đốt, đốt cuối có màu đỏ. Bụng và cánh có màu xanh đen, ngực có màu đỏ. Chân
dài, hay chạy và ít khi bay (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).
Thành trùng đực có đốt râu cuối hình ống dài, con cái có hình trứng. Trứng hình bầu
dục, dài 0,5-0,7mm, thời gian ủ trứng từ 5-10 ngày. Ấu trùng thon dài, đầu nâu, thân
trắng, không chân, bụng chia đốt, cơ thể dài khoảng 5-8,5mm, ấu trùng có 5 tuổi, thời
gian phát triển từ 15-20 ngày. Nhộng màu trắng, dài 4-8mm, thời gian nhộng 4-10
ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).

Hình 1.2. Thành trùng sùng khoai lang
(nguồn: http://cookislvàs.bishopmuseum.org/MM/MX5/5AUt116_Cyla-form_MoACollCK1_GM1_MX.jpg truy cập ngày 29/04/2012)

13


1.2.3. Tập quán sinh sống
Trong quyển Bách khoa toàn thư về côn trùng, xuất bản năm 2008 tại Mỹ, tác giả John
l. Capinera có đề cập:
Sùng cái dùng miệng để tạo những khoang nhỏ trong củ hoặc thân khoai, sau đó để
trứng vào những khoang đó. Trứng được đẻ riêng lẻ, được đính trong vị trí đẻ trứng và
được bịt kín bởi phân của con cái, giúp cho trứng khó bị phát hiện. Hầu hết các trứng
có xu hướng được đẻ gần vị trí giao nhau giữa thân và củ. Đôi khi thành trùng bò
xuống qua vết nứt của đất, vào trong củ để đẻ, giúp trứng yên vị trong củ.
Khi trứng nở, ấu trùng thường đục vào bên trong củ hoặc thân cây. Những ấu trùng nở
ở thân thường đục xuống phía củ. Ấu trùng tạo những đường hầm quanh co, trực tiếp
ăn và thải phân tại đó. Khi chuyển qua giai đoạn nhộng, thành trùng tạo kén bên trong
rễ hoặc thân. Nhộng lúc đầu có màu trắng, sau chuyển dần sang xám.