Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành dưới sự giúp đỡ tận tình của thầy (cô)
khoa Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 cùng cán bộ Viện Hóa Sinh
Biển – Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Với tất cả lòng biết
ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng đã giao
cho em đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Phan Văn Kiệm cùng
các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc hóa học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
em trong quá trình làm thực ngiệm để hoàn thành khóa luận này.
Khóa luận này được hoàn thành với hỗ trợ của đề tài “ Nghiên cứu sản
xuất một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị hội chứng
hô hấp trên lợn và gà’’ do PGS.TS. Lã Văn Kính, Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp miền Nam làm chủ nhiệm đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy (cô) khoa Hóa học trường Đại Học
Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong thời gian học tập, tu dưỡng tại trường.
Bản thân em đã cố gắng để hoàn thành khóa luận, nhưng cũng không
tránh khỏi những thiếu xót. Vì vậy, em kính mong sự đóng góp ý kiến quý
báu của thầy (cô) và các bạn đọc để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Mai Hương

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học



NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 25
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 25
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất. ................................................... 25
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 25
Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ...................................................................... 25
2.2.3. Sắc ký cột (CC)...................................................................................... 25
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. ...................... 25
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ........................................................................... 25
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) ...................................................................... 26
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)..................................................... 26
2.3.4. Độ quay cực []D ................................................................................. 26
2.4. Dụng cụ và thiết bị. ................................................................................ 26
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết. .............................................................. 26
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc. .................................................. 27
2.5. Hoá chất. ................................................................................................. 27
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................... 28
3.1. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất.......................................... 28
3.1.1. Xử lý mẫu .............................................................................................. 28
3.1.2. Chiết tách và phân lập các hợp chất ..................................................... 28
3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất. ................................. 31
3.2.1.Hợp chất 1 - Sanggenon J. ..................................................................... 31

Hình 1.3

Flavon

8

Hình 1.4

Flavonol

8

Hình 1.5

Flavanon

9

Hình 1.6

Flavonon và Chalcon

9

Hình 1.7

Flavanonol-3

9


Hình 1.13

Leucoantoxianidin

11

Hình 1.14

(-) Catechin

11

Hình 1.15

(+) Catechin

12

Hình 1.16

3-phenyl chromen

12

Hình 1.17

Isoflavon

12



Hình 4.1.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 1

Nguyễn Thị Mai Hương

33

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Hình 4.1.c

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Phổ 13C và DEPT của hợp chất 1

33

Hình 4.1.d Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 1

34

Hình 4.1.e

Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1

35


Bảng 4.1.1 Số liệu phổ của hợp chất 1

36

Bảng 4.2.2 Số liệu phổ của hợp chất 2

40

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

C NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1


FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High
Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC


khoảng trên 10 chi với gần 140 loài được phân bố rộng rãi khắp nước, bao
gồm cả cây trồng và cây mọc dại, nhiều loài có giá trị kinh tế cao.
Cây dâu tằm ( Morus alba), thuộc họ dâu tằm ( Moracae) là cây được
sử dụng để chữa bệnh từ rất lâu, lá dâu dùng để chữa cảm mạo, hạ huyết
áp,làm lành vết thương; vỏ và rễ dâu chữa chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng
huyết; cành dâu non có tác dụng trừ phong, lợi các khớp, thông kinh lạc, tiêu
viêm……

Nguyễn Thị Mai Hương

1

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận
tốt nghiệp là:
“Nghiên cứu phân lập các flavonoit từ lá dâu tằm (Morus alba)’’
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Thu mẫu từ lá cây dâu tằm (Morus alba), xử lý mẫu, tạo dịch chiết;
2. Phân lập các hợp chất flavonoit thu được từ dịch chiết lá cây dâu tằm
(Morus alba).
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Nguyễn Thị Mai Hương


mọc hoang là màu tím sẫm. Rễ ăn sâu và rộng
2-3m. Phân bố nhiều ở tầng đất 10-30m và
rộng theo tán cây.

Hình 1.1: Lá cây dâu.

Nguyễn Thị Mai Hương

3

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.1.2. Phân bố và sinh thái
Nguyên sản ở Trung Quốc, được trồng rộng rãi ở các nước Châu Á.
Ở Việt Nam, đã được trồng từ lâu đời khi người ta biết nuôi tằm. Cây
được trồng nhiều ở các tỉnh Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh.
Cây dâu ưa đất phù sa, bãi bồi, đất ẩm xốp và khí trời ấm áp.
1.1.3. Công dụng
Lá dâu (Tang diệp) có vị đắng, tính bình, có tác dụng tán phong, thanh
nhiệt, lương huyết chữa cảm mạo,hạ huyết áp, làm sáng mắt, chữa chứng mồ
hôi trộm ở trẻ con, chứng thổ huyết, làm lành vết thương.
Vỏ rễ dâu (Tang bạch bì) đã cạo sạch lớp vỏ ngoài, phơi hay sấy khô,
có vị ngọt hơi đắng, tính mát,có tác dụng thanh phế nhiệt, lợi thủy, hạ suyễn,
tiêu sưng, chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng huyết.
Cành dâu non (Tang chi) đã phơi hay sấy khô có vị đắng nhạt, tính

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Vỏ rễ cây dâu tằm chứa mulberin, cyclomulberin, mulberochomen,,
cyclomulberochromen, mulberanol, oxydihydromorusin (morusinol), kuwanon,
mulberofuran, albanol, albafuran, albafuran B, C. Ngoài ra, vỏ rễ còn chứa ptocopherol, umberiferon, socopoletin, ethyl 2,4 - dihydrobenzoat, 5,7dihydroxychoromon, morin (3,5,7,2’,4’- pentahydroxyfalavon) dihydromorin,
dihydrokaemferol, acid betulenic, 2,4,4’,6-tetrahydroxybenzophenol (R=H),
macrulin (2,3’,4,4’,6-pentahydroxybenzophenol (R=OH), sitosterol, resinotanol.
1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây dâu tằm (Morus alba).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số hợp chất phân lập từ rễ cây
dâu tằm có nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất flavonoid.
Năm 1986, Hirakura đã cô lập được hợp chất Mulberrosid từ rễ cây dâu
tằm và đã thử nghiệm thành công hoạt tính kháng virus Herpes simplex-l
(HSV-l: một loại virus gây viêm não)[10].
Các công trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản (1994) [11],
Trung Quốc (1996)[12] đã chứng minh polyphenol chứa trong lá dâu có nhiều
tác dụng quý và có thể ứng dụng trong sinh học như: làm hạ glucose máu,
chống oxy hóa, hạn chế rối loạn lipit máu.
Năm 2003, K.M.Park và các cộng sự đã phân lập được hợp chất
Kuwanon G từ rễ cây dâu tằm, các nghiên cứu cũng cho thấy hợp chấy này có
thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus (vi khuẩn gây ra nhiễm trùng) và các
loại vi khuẩn Cariogenic như S. mutans (loại khuẩn này chuyên bám trên bề
mặt răng và tạo cao răng)……
Khi dùng cloroform để chiết các hợp chất hữu cơ từ rễ cây dâu tằm, các
nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện dung dịch thu được có tác dụng bổ trợ
cho trực khuẩn Bacillus subtilis phát triển mạnh, trực khuẩn này sinh nhiều

Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật, có cấu tạo gồm 2
vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon
C6 – C3 – C6.
Flavonoit xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng.
Sự tiến hoá của Flavonoid liên quan đến quá trình tiến hoá thực vật. Từ
các loài có gỗ sơ khai đến các loài cây bụi đã phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi
quan trọng về mặt cấu trúc của Flavonoid:
- Sự biến mất Proantoxianidin trong lá.
- Sự mất 3 nhóm OH ở vòng benzen.
- Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin).

Nguyễn Thị Mai Hương

6

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các
glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu
đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin
là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào).
Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hoá học
và tác dụng sinh học. Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt
trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B
được kết nối bởi 1 dị vòng C với khung các bon C6-C3-C6. Tại các vòng có đính

5

4

6'

C

Hình 1.2: Flavan (2- phenyl chromen )
1.2.2. Các nhóm flavonoit
1.2.2.1 Flavon và flavonol
Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Công thức
cấu tạo của các hợp chất như sau:

Nguyễn Thị Mai Hương

7

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

O

O
OH


RO

O

Hình 1.5: Flavanon
Các flavanon tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến với các chalcon, do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcon.
OR
O

OH

OR

[OH]

RO

[H]

O

O

Hình 1.6: Flavonon và Chalcon

Nguyễn Thị Mai Hương

8


O
Taxifolin

Hình 1.8: Taxifolin
1.2.2.4. Chalcon.
Chalcon khác với các loại Flavonoid khác là nhóm chalcon gồm hai
vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên tử
cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B.

Nguyễn Thị Mai Hương

9

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OR
OH
RO

O

Hình 1.9: Chalcon
Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 hợp chất chalcon, ngoài ra còn
thấy hợp chất dihydrochalcon. Tuy vậy, giữa chalcon và dihydrochalcon hầu
như không có mối quan hệ khăng khít nào. Chalcon có thể bị đồng phân hoá

10

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OR

O
RO

OH

Hình 1.11: Antoxianidin
Màu sắc của antoxianidin thay đổi theo pH. Trong dung dịch axit vô
cơ, antoxianidin cho muối oxoni có màu đỏ, còn trong môi trường kiềm
chúng tạo thành các anhydrobazơ với một nhóm quinoid màu xanh:
HO

OH HO

O

O

O


OH
O

Hình 1.13: Leucoantoxianidin
1.2.2.8. Catechin.
Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol. Do có hai trung tâm cacbon bất
đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang.

Nguyễn Thị Mai Hương

11

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OH

O
HO

OH

OH
OH

Hình 1.14: (–) Catechin

Iso flavon

Iso flavanon

Hình 1.17: Isoflavon
Nguyễn Thị Mai Hương

Hình 1.18: Isoflavanon
12

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2.2.10. Rotenoid và neoflavonoid.
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng như sinh tổng hợp. Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức như sau:

H
O

O
O

H
O


- Flavonoid glycozit là các flavon và các flavonol có nhiều nhóm –OH,
các biflavon là các chất phân cực mạnh thì người ta dung các dung môi phân
cực như CH3OH, C2H5OH.
- Aglycon, các flavon, flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm –OH là
những chất có độ phân cực yếu. Để chiết chúng, người ta dùng các dung môi
phân cực yếu như C6H6, CHCl3, CH3COOC2H5.
Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này cần được chưng
cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Có một số chất dẻo thường lẫn
trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl
axetylcitrar. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất
hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các
thùng chứa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metyl
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…
Những tạp chất của chlorofom như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng
với vài hợp chất như các ancaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.
Tương tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Chlorofom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với
chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt
nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofom.

Nguyễn Thị Mai Hương


phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp

Nguyễn Thị Mai Hương

15

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình
tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.2. Qúa trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước

anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.[7, 8]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu
hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá
trình sắc ký.

Nguyễn Thị Mai Hương

17

K35C – Khoa Hóa học



hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết
sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng
tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng

Nguyễn Thị Mai Hương

18

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy
được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp
suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này
mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp
phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ
này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ
số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong
khoảng 1/20-1/30.