Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
LỜI CẢM ƠN
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công,
người đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và
toàn thể các thầy cô khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
SVTH: Nguyễn Thị Dung
1
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
LỜI CAM ĐOAN
Bảng 3.2.
Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông
nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc
M4V ......................................................................................... 29
Bảng 3.3.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase .................................................................................... 30
Bảng 3.4.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase ................ 31
Bảng 3.5.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ............ 33
Bảng 3.6.
Hàm lượng đường tổng số của các mẫu cơ chất trước và
sau khi lên men ......................................................................... 35
Bảng 3.7.
Hàm lượng protein của các mẫu cơ chất trước và sau khi
lên men ..................................................................................... 37
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
Cs
: Cộng sự
CMC
: Cacboxyl methyl cellulose
CMC – ase
SVTH: Nguyễn Thị Dung
: Cacboxylmethylcellulase
5
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thị Dung
6
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
1.5.2. Nguồn dinh dưỡng .............................................................................. 15
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.......................................................... 15
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ............................................................... 15
1.5.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................. 16
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 16
1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ...................................................................... 16
1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................... 17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 18
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật ..................................................................... 18
2.1.1.Chủng vi sinh vật ................................................................................. 18
2.1.2. Nguyên liệu ........................................................................................ 18
2.1.3. Hóa chất – thiết bị .............................................................................. 18
2.1.4. Môi trường ......................................................................................... 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................... 20
2.2.1.1. Thu thập mẫu ................................................................................... 20
2.2.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản..................................... 20
2.2.1.3. Hoạt hoá vi sinh vật ......................................................................... 20
2.2.2. Phương pháp hoá sinh ........................................................................ 21
dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng trong chăn nuôi ............................ 35
3.3.1. Kiểm tra hàm lượng đường tổng số của môi trường trước và sau
khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V ....................................................... 35
3.3.2. Kiểm tra hàm lượng protein của môi trường trước và sau khi lên
men bằng chủng nấm mốc M4V ................................................................... 37
3.3.3. Phân tích hoạt tính cellulase của các mẫu nghiên cứu ......................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 40
SVTH: Nguyễn Thị Dung
8
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với
hàng loạt các vấn đề nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát
và giá thức ăn chăn nuôi cao,… Chính vì vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang
đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền nông nghiệp bền
vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới
và nhiều cạnh tranh này.
Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề
được đặt ra là đầu ra cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch
Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng
nấm mốc và đã biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế
biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông
nghiệp…Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về
cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã
ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose
làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách
sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò;
Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật
có khả năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase
phục vụ cho chăn nuôi… và đã thu được kết quả cho nhiều triển vọng.
Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên
cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải
cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi”
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc
phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục
vụ chăn nuôi.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh
cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp.
3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ
sung vào thức ăn làm tăng năng suất vật nuôi.
SVTH: Nguyễn Thị Dung
10
K35B – SP Sinh
với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose
cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng
hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và
trong bông chiếm khoảng 90%) [27].
Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên
kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô
định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với
nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất. Ngược lại,
trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn
công [27].
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và
định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Ao và xếp xen kẽ
với vùng vô định hình [27].
SVTH: Nguyễn Thị Dung
12
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi.
Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp
thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân.
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose.
Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose
làm thức ăn [24].
1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực
vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng
cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ. Cùng với cellulose,
hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính
chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất
này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose
(Bảng 1.1) [27].
SVTH: Nguyễn Thị Dung
14
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
25-35
Vỏ lạc
25-30
25-30
30-40
Lõi ngô
45
35
15
Giấy
85-99
0
0-15
Vỏ trấu
32.1
80-95
5-20
0
Giấy báo
40-55
25-40
18-30
Giấy thải từ bột giấy hoá học
60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu
8-15
-
24-29
12
25-40
25-50
10-30
33.4
30
18.9
Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)
Bã thô
SVTH: Nguyễn Thị Dung
15
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose
thành glucose [28].
1.3. Ứng dụng của cellulase
1.3.1. Cellulase với công nghiệp thực phẩm
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt
trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành
trồng trọt và nông nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân
giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở
nên vô ích hay cản trở tiêu hoá. Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng
chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ
nguyên liệu thực vật [31].
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng
nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực
phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng
thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau
quả cải bắp, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn
xử lí cả chè và các loại tảo biển,… [25].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt
đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá.
Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất
lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.
Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật
SVTH: Nguyễn Thị Dung
17
K35B – SP Sinh
mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hoá. Sự kết hợp của glucanase và pectinase
SVTH: Nguyễn Thị Dung
18
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
sẽ phá huỷ hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch
hoá bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả
của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong
công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase
đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng
diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [15].
Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng
tới khả năng lọc và gây đục cho bia [15].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản
xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không
cao. Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được
áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử
lí bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng trích li dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,
cellulase gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng
thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thương
mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lượng cà phê
được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như
tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được
nghiên cứu và sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà
máy giấy tạo ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao).
Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide
quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy nước
thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung
các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [33].
1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng ở thức ăn ở mức cao
nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ
sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme
có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn,
giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn [3].
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi cho gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm
enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase,
protease, xylanase,…tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme. Việc
SVTH: Nguyễn Thị Dung
20
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
21
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Cellvibrio gilvus, cellvibrio fulvus [7].
1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces)
Actimimyces coelicolor; Act. sulfureus.
Act. cellulosae; Act. diastaticus.
Act. hydroscopicus; Act. themofuscus.
Act. bovis; Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala [7].
1.4.3. Nấm sợi
Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là
nấm (nấm mốc và nấm quả thể). Rất nhiều loài nấm đã tổng hợp cellulase có
hoạt tính khá cao trong đó đáng kể là một số chủng loại sau:
Asp. flavus; Asp. niger; Asp. oryzae; Asp. terreus;
Asp. amstelodamy; Asp. fumigates.
Chaetomium globosu …
Mucor pusillus.
Penicillium notatum, Pen. variabite; Pen. pusillum…
Tricoderma koningi; Trlignorum Tr. viride.
Sporotrichum pruinosum.
Myro thecium verrucaris.
Chrysosporium lignorum [7].
1.5. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzyme. Đối với nấm sợi A. fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn
cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trường cám bã và
củ cải đường là môi trường thích hợp nhất với T. reesei [10].
Bã mía là nguồn cellulose tự nhiên tốt cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase của A. niger, A. elipticus và A. fumigatus, T. reesi kết hợp với
A. phoenicis, Penicilium sp, A. terreus…còn lõi ngô, vỏ cà phê, xơ cọ dừa lại
là nguồn cellulose thích hợp cho các chủng vi sinh vật khác [10].
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng như enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh
vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để
đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [13].
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông
(Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối
SVTH: Nguyễn Thị Dung
23
K35B – SP Sinh
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá
trình tổng hợp, vì môi trường các muối này làm cho môi trường axit hoá. Điều
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Theo
Lương Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp. awamori để sản xuất
enzyme nhiều nhất vào thời điểm khoảng 36-40 giờ [13]. Đối với nấm mốc
Aspergillus tạo thành enzyme cao nhất lúc bắt đầu sinh bào tử, sau khi sinh
bào tử lượng enzyme tiết ra ít thậm chí giảm đi rất nhiều [7].
SVTH: Nguyễn Thị Dung
25
K35B – SP Sinh
Copyright: Tài liệu đại học ©