TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

--------***--------

NGUYỄN THỊ LAN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI
KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ
KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL
CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội – 2011


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

MỤC LỤC
Trang

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

1

2. Mục tiêu của đề tài

1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose

7

1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

8

1.3. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới

9

và ở Việt Nam
1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới.

9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam

11

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị

12

2.1.1. Vi sinh vật

12


14

2.2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên
kính hiển vi

14

2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1]

14

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh
hoá của các chủng Acetobacter xylinum

15

2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11]

15

2.2.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá
rượu ethanol thành acid acetic [11]

15

2.2.3.3. Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11].

15

2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose

21

iii

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

3. 2. Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo
màng BC dai, mỏng

24

3.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng
Acetobacter xylinum đã tuyển chọn

27

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học của các
chủng Acetobacter xylinum

27

3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum

28


iv

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU
Trang

HÌNH
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn A.xylinum

4

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose của thực vật

7

Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum

9

Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum

17

Hình 3.2. Một số mẫu màng thu được sau khi làm giàu nguyên liệu


5

Bảng 1.2. Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

6

( so sánh với Pseudomonas )
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC

25

Bảng 3.2. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum

28

Bảng 3.3. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng R1 và B4

30

Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủng R1 và B4

31

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng
của chủng R1 và B4

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

32


BHN2

Acetobacter xylinum BHN2

cs

Cộng sự

Cty

Công ty

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

vi

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hàng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn để lại di chứng đến khả năng
vận động, thẩm mĩ và sức khỏe của người bệnh. Ở Việt Nam, riêng viện bỏng
quốc gia Hà Nội mỗi năm tiếp nhận khoảng 3000 bệnh nhân bỏng do đủ các


K33 Khoa Sinh – KTNN

thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer lớn...
rất thích hợp làm màng trị bỏng. Thế giới đã có nhiều nghiên cứu về màng trị
bỏng từ cellulose vi khuẩn. Ở Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này còn rất
ít, mới chỉ có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh (2008) và
nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung (2009) được công bố. Các loại màng trị
bỏng của chúng ta hiện nay phần lớn là nhập ngoại với giá rất đắt đỏ.
Từ những lí do nói trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu:
“Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng

tạo màng Bacterial Cellulose ( màng BC ) có đặc tính dai, mỏng”
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) từ một
số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum đã phân lập có khả năng tạo màng
Bacterial Cellulose dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng đã tuyển chọn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo màng Bacterial
Cellulose (BC) dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A.xylinum.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Đề tài nghiên cứu lựa chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo
màng BC dai mỏng. Có triển vọng ứng dụng trong chế tạo màng trị bỏng.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân


2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn có chứa hemicellulose.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

3

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

1m

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn A.xylinum [36]
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.
* Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [18]. Ngược lại trong
điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không
đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình
thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [13].


Đặc điểm

Hiện tượng

Kết
quả

1

Chuyển hoá môi trường chứa
Oxy hoá ethanol thành
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
acid acetic
xanh sang màu vàng

+

2

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

3

Sinh trưởng trên môi
trường Hoyer

sinh sắc tố nâu

Không hình thành sắc tố nâu

_

7

Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

5

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Theo Bergey (1984) [4], Acetobacter xylinum được xếp vào chi
Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là
Acetobacter và Gluconobacter. Đặc điểm phân biệt giữa 2 chi được trình bày
trong bảng 1.2


+

-

-

+

+

-

+

+

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-


1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose cấu trúc màng BC có thành phần hóa học tương tự cellulose
thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau.

Sợi cellulose của màng BC

Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose
của thực vật [35]
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng, có đường kính sợi nhỏ hơn rất nhiều so với sợi cellulose của thực vật,
đồng thời khả năng kết tinh cao (khoảng 60 %), độ polimer hóa lớn nên màng
BC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước lớn [18]. Đây là đặc tính
ưu việt hơn hẳn so với cellulose thực vật. Khi quan sát trên kính hiển vi điện
tử thấy đường kính của sợi cellulose vi khuẩn chỉ bằng 1/100 của sợi cellulose
thực vật.[35]
Do có những đặc điểm ưu việt như trên mà màng BC đã được ứng dụng
rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Một trong các lĩnh vực
đáng lưu ý đó là lĩnh vực y học. Trong lĩnh vực này, màng BC được ứng dụng
để sản xuất màng trị bỏng [22],

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

7

SV: Nguyễn Thị Lan


8

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Hình 1.3 Sự hình thành những dải ribbon trong màng
BC của A.xylinum [22]
Kích thước của dải ribbon còn nhiều ý kiến chưa đồng nhất, nó có thể
đạt từ 3-4 x 70-80 nm [33], 3,2x133 nm (Brown và cs, 2000). Những dải
ribbon từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải ribbon khác
bằng liên kết hydro hoặc liên kết Van de Van tạo thành dạng sệt (gel) hay
một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn
sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà
màng BC được mở rộng [12], [19]
1.3. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt
Nam
1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới.
Do có nhiều ứng dụng nên A.xylinum đã thu hút được rất nhiều sự quan
tâm của các nhà khoa học trên thế giới và đã có rất nhiều công trình nghiên
cứu lớn nhỏ ở khắp các quốc gia.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

9

SV: Nguyễn Thị Lan

nuôi cấy đến khả năng hình thành màng BC; Neelobon Suwannapinunt và
cộng sự (2007) nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC [28]; nghiên cứu về
gen sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum có công trình nghiên cứu của các tác

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

10

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

giả như C. Wong và cộng sự (1990) [32], Dag H. Coucheron (1991; 1993)
[20], [21].
1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Ở Việt Nam những vấn đề nghiên cứu về A.xylinum và màng BC trong
điều trị bỏng là khá mới mẻ. Có rất ít các nghiên cứu liên quan đến A.xylinum,
sự hình thành màng và ứng dụng của màng. Các công trình mới chỉ bước đầu
nghiên cứu về quá trình tạo màng, đặc tính, cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo
màng trị bỏng : nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Văn Thanh và ThS.
Huỳnh Thị Ngọc Lan (2006) đã tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng trị
bỏng có màu trắng với độ dày 0,5mm và có kích thước khác nhau tùy theo
yêu cầu sử dụng; nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung khi tiến
hành khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum đã phân
lập tuyển chọn được 65 chủng vi khuẩn trong đó có chủng BHN2 có triển
vọng ứng dụng tốt.
Ngoài ra còn có các nghiên cứu của các tác giả như:

- Chủng BHN2 do PTN Vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung
cấp.
2.1.2. Thiết bị và hoá chất
2.1.2.1. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
Nồi hấp Tommy (nhật)
Box vô trùng (Haraeus)
Máy lắc TEIO TECH (Hàn Quốc)
Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
Kính hiển vi quang học LABOMED ( Mỹ)
Tủ lạnh Electrolux,
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và
nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.1.2.2. Hoá chất
- Glucose (Cty dược trung ương MEDPLANTEX Hà Nội – Hải
Phòng), Saccharose.
- Agar ( Cty TNHH Hải Long – Hải Phòng)
- Rượu ethanol, acid acetic ( Cty hóa chất Đức Giang - Hà Nội)

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

12

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

pH: 5,0 – 6,0

Acid acetic : 2%

Nước dừa: 1000 ml
2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3g
KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 – 6,0

Acid acetic : 2%

Nước dừa: 1000 ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter
Phân lập vi khuẩn theo phương pháp của Winogradski và Beijerinck
[11] – Phân lập sau khi đã làm giàu.
Nguồn vật liệu: Mẫu màng lên men giấm tự nhiên từ các nguồn bia hơi
Hà Nội, rượu vang, dịch quả (chuối), nguồn vô cơ (saccharose và ethanol).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

13

SV: Nguyễn Thị Lan



- Bề mặt: Bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

14

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

- Cấu trúc khuẩn lạc: Đồng nhất, dạng hạt nhỏ, dạng hạt lớn...
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng
Acetobacter xylinum
2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11]
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi
bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +).
Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -).
2.2.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá rượu ethanol thành
acid acetic [11]
Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:
Cao nấm men: 10g

Rượu ethanol : 10%-15% (vol/vol)

Nước máy: 1000ml

pH : 6,8-7.0


K33 Khoa Sinh – KTNN

Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetate
bị oxy hoá, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không là âm tính.
2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong
vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt mầu của
màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch Lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá
thành màu xanh lam.
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng khô của màng BC
Mẫu màng cần xác định trọng lượng được lọc lên giấy lọc. Giấy đã được sấy ở
1050C trong 2 giờ đến khi trọng lượng không đổi và xác định trọng lượng trước khi
lọc. Giấy lọc cùng với mẫu được đặt trong đĩa petri, làm khô trong tủ sấy cũng trong
1050C. Sau 2 giờ để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân lại. Trọng lượng khô của
màng là hiệu số của trọng lượng giấy lọc có và không có mẫu màng.
2.2.5. Phương pháp xác định khả năng thấm hút nước của màng BC
(g/100cm3)
- Đặt mẫu màng nghiên cứu vào hộp Petri sấy ở nhiệt độ 400C trong 24 giờ
[11]. Cân khối lượng màng.
- Thả mẫu màng ngập trong nước. Sau 12 giờ thu màng, cân khối lượng
màng.
- Lượng nước hút được là hiệu số của khối lượng màng sau 12 giờ và khối
lượng màng ban đầu.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

16

SV: Nguyễn Thị Lan

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Khâu 1 trong qui trình, làm giầu mẫu nguyên liệu là để cho các vi
khuẩn trong không khí có điều kiện phát triển, sinh sản, tăng số lượng trên
môi trường chứa nguyên liệu ta đã chuẩn bị để thu được nhiều tế bào vi khuẩn
dùng cho các khâu phân lập, tuyển chọn tiếp theo. Mục tiêu của các khâu 2, 3,
4, 5 là phân lập, thu các chủng thuộc chi Acetobacter, loại bỏ các chủng thuộc
chi Gluconobacter và khâu 6,7 là tuyển chọn các chủng A.xylinum từ các
chủng thuộc chi Acetobacter. Cụ thể:
3.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu
Bước 1: Xử lý nguyên liệu
- Bia, rượu vang được pha loãng; chuối được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn
tuỳ loại.
- Nguyên liệu sau khi xử lý bổ sung nước với lượng thích hợp.
Bước 2: Lên men etylic
Lên men etylic dịch nguyên liệu nhờ nấm men có sẵn trên bề mặt nguyên
liệu. Nguyên liệu được cho vào bình đậy chặt từ 5 đến 7 ngày. Sau đó mở hé
miệng đuổi khí CO2 1lần/ngày rồi đậy chặt.
Bước 3: Lên men acetic
Sau 8 ngày bỏ nắp bình, dùng vải màn đậy kín miệng bình để ở nhiệt độ
thích hợp ở những vị trí khác nhau. Sau khoảng 5 đến 7 ngày trên bề mặt môi
trường xuất hiện một lớp màng dày, mỏng khác nhau.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân


bằng cách cấy thuần trên môi trường 2 có bổ sung thêm CaCO3 (7g/l). Các
chủng Acetobacter có khả năng sinh acid acetic, acid này phân giải CaCO3

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

19

SV: Nguyễn Thị Lan

Trích đoạn Tuyển chọn các chủng A.xylinum tạo màng

---