BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM
KHOA SINH HỌC
[”\

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ
NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG
KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN
Mã số: CS.2010.19.89.

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

ThS. NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM
KHOA SINH HỌC
[”\

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG


giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tinh hóa VS2 (TCM-199 + 10% FBS +
20% DMSO + 20% EG + 1 M sucrose) để trong 25 giây, sau đó nạp từ 5 - 7 tế
bào trứng vào cọng rạ (0,25 ml) và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 45 giây
kể từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản). Giải đông tế bào trứng như sau:
(i) lấy cọng rạ chứa tế bào trứng ra khỏi bình nitơ lỏng và để trong không khí 5
giây, nhúng vào nước ấm 37oC trong 10 giây, sau đó chuyển tế bào trứng vào đĩa
nhựa trống (Φ35); (ii) Các tế bào trứng lần lượt được chuyển qua môi trường rã
đông thứ nhất (RĐ1: TCM-199 + 10% FBS + 0,25 M sucrose) trong 1,5 phút,
RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15 M sucrose) khoảng 1,5 phút và RĐ3 (TCM199 + 10% FBS) trong 5 phút; (iii) Tiếp tục chuyển tế bào trứng qua môi trường
C3 trong khoảng 3 phút. Quá trình giải đông tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC).
Chọn những trứng còn nguyên vẹn về hình thái đem IVF (nội dung 2) và ICSI
(nội dung 3). Kết quả nội dung 1: Đông lạnh 3154 trứng dùng cho IVF, thu được
80,07 ± 2,72% trứng còn nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái);
Đông lạnh 837 trứng dùng cho ICSI, thu được 79,89 ± 5,28% trứng còn nguyên
vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái). Kết quả nội dung 2: Tiến hành thụ
tinh cho 1970 trứng sống tốt sau khi giải đông, chỉ có 306 trứng được thụ tinhgiai đoạn phôi 2 tế bào, chỉ đạt tỷ lệ 15,21 ± 3,48%. Trong khi ở lô đối chứng, tỷ


ii
lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% (234 phôi 2 tế bào). Có 82 (4,14%) phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang trong khi ở lô đối chứng có 93 phôi (23,25%).. Kết quả
nội dung 3: Tiến hành ICSI cho 595 trứng sống tốt sau khi giải đông và 375
trứng tươi chưa qua đông lạnh. Tỷ lệ thụ tinh ở lô thí nghiệm chỉ đạt 8,95%
(23/240 trứng) so với 30,82% (89/288 trứng) ở lô đối chứng; có 2 phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang so với 16 phôi (5,44%) ở lô đối chứng.


iii

SUMMARY

(93 embryos), respectively. In experiment 3: After 22-24h incubated with sperm,


iv
23/240 (8,95%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized
oocytes in the control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); 2 embryos developed
into blastocyst stage in experiment and control was 16 embryos.


v

MỤC LỤC
Tóm tắt đề tài (tiếng Việt và tiếng Anh).........................................................i
Mục lục .........................................................................................................v
Danh mục bảng .............................................................................................vi
Danh mục hình..............................................................................................vi
Danh mục từ viết tắt......................................................................................iv
PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... viii
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................1
2. Mục tiêu đề tài ...........................................................................................2
3. Cách tiếp cận đề tài....................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................2
5. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................3
6. Nội dung nghiên cứu .................................................................................3
7. Sản phẩm đề tài..........................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................6
1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG ............................................6
1.1.1. Khái niệm đông lạnh trứng ..................................................................6
1.1.2. Mục tiêu của đông lạnh trứng ..............................................................6
1.2.3. Những nét cơ bản về bảo quản trứng đông lạnh bằng ...........................

2.3.1. Chuẩn bị hóa chất ..............................................................................30
2.3.2. Chuẩn bị trứng ...................................................................................30
2.3.3. Chuẩn bị hệ thống thao tác ................................................................31
2.3.4. Tiến hành ICSI...................................................................................31
2.3.5. ICSI trứng tươi...................................................................................32
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU..................................................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................33
3.1. KẾT QUẢ NỘI DUNG 1 .....................................................................33
3.2. KẾT QUẢ NỘI DUNG 2 ....................................................................35
3.3. KẾT QUẢ NỘI DUNG 3 .....................................................................40
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ.........................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................46
Phụ lục

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đông lạnh trứng dùng cho IVF.................................................33
Bảng 3.2. Kết quả đông lạnh trứng dùng cho ICSI................................................34

Bảng 3.3. Kết quả IVF từ trứng đông lạnh ..................................................35
Bảng 3.4. Các giai đoạn phát triển của phôi ................................................37
Bảng 3.5. Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính ............................
ở trứng đông lạnh .......................................................................38
Bảng 3.6. Kết quả ICSI từ trứng đông lạnh .................................................40

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn phát triển của phôi ................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí toàn bộ thí nghiệm trong đề tài ................................24
Hình 2.2. Cọng rạ chứa trứng ................................................................................26

Hình 2.3. Lấy cọng rạ chứa tinh trùng ra khỏi bình nitơ lỏng .....................28

Thụ tinh trong ống nghiệm

Sperm

Injection
Polymerase

Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

Chain

Reaction
Loop-Mediated
Isothermal Amplification

IVM

In Vitro Maturation

Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm

ICM

Inner Mass Cell

Khối tế bào bên trong

TE

Trophectoderm Cell


EG

Ethylene glycol

BO

Brackett and Oliphant

Môi trường BO

RĐ

Rã đông

cs.

Cộng sự

TN

Thí nghiệm

ĐC

Đối chứng


1


thoi vô sắc, nhiễm sắc thể, và đặc biệt là màng tế bào, gây trở ngại cho quá trình
thụ tinh. Cho đến nay, người ta đã thu nhận được một số kết quả thụ tinh trong
ống nghiệm từ tế bào trứng đông lạnh: năm 2003, Shinichi Hochi đã thành công
với tỷ lệ trứng bò thụ tinh sau giải đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst


2

Mở đầu

là 5% [44]; năm 2008, Morato đã đưa ra tỷ lệ thụ tinh đối với tế bào trứng bò sau
khi thủy tinh hóa bằng vi giọt là 46,1% và sau sự thụ tinh trong ống nghiệm 5,3%
trứng bò phát triển đến giai đoạn phôi nang [37]. Vì thế, các nghiên cứu nhằm
nâng cao tỷ lệ tạo phôi nang (blastocyst) từ trứng bò đông lạnh vẫn đang được
thực hiện ở nhiều nước.
Tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng bò đông lạnh ở nước ta mới
chỉ có Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. thực hiện (2009) với tỷ lệ thụ tinh là
11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang [3]. Những công trình nghiên cứu theo
hướng này còn rất ít cũng như tỷ lệ thành công còn thấp. Chính vì vậy, chúng tôi
đề xuất đề tài “Tạo phôi bò (hoặc phôi heo) từ nguồn trứng đông lạnh bằng
kỹ thuật hỗ trợ sinh sản”. Hy vọng kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp
phần thúc đẩy và hoàn thiện công nghệ tạo phôi in vitro từ nguồn trứng bò đông
lạnh nói riêng và trứng đông lạnh của động vật hữu nhũ nói chung tại Việt Nam.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Tạo được phôi bò từ nguồn trứng đông lạnh bằng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản
3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI
• Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề
này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện
phòng thí nghiệm cho phép ứng dụng Công nghệ Sinh học.
• Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật,

(IVF)
• NỘI DUNG 3: Tạo phôi bò bằng kỹ thuật tịêm tinh trùng vào bào
tương trứng (ICSI)


4

Mở đầu

7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả khoa học
Đã tiến hành được quy trình thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) từ nguồn
trứng bò đông lạnh thành công.
Đã tiêm được tinh trùng vào bào tương trứng bò đông lạnh (ICSI).
Kết quả sản phẩm
•

Đã đông lạnh được 3991 trứng bò trưởng thành: 3154 trứng dùng cho thí
nghiệm IVF với tỷ lệ sống sau giải đông là 80,07 ± 2,72%; 837 trứng được
dùng cho thí nghiệm ICSI với tỷ lệ sống sau giải đông là 79,89 ± 5,28%.

•

Đã thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm cho 1970 trứng đông lạnh với tỷ lệ
thụ tinh đạt 15,21 ± 3,48% và đã có 4,14 ± 1,86% (82 phôi) phát triển đến
giai đoạn phôi nang; 400 trứng tươi với tỷ lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% và đã
có 23,25 ± 2,94% (93 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang.

• Đã thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng cho (1) 595 trứng đông
lạnh: 240 vi tiêm thành công, 23 trứng đã thụ tinh (8,95 ± 7,49%) và đã có

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG
1.1.1. Khái niệm đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng là kỹ thuật bảo quản chức năng bình thường của trứng
trong một thời gian dài khi giảm nhiệt độ sinh lý của trứng (từ 37OC, 5% CO2)
xuống dưới nhiệt độ xảy ra các phản ứng sinh hóa ở -196OC (nhiệt độ dưới nhiệt
độ sinh lý). [5]
Theo các nhà khoa học trên thế giới, quy trình đông lạnh và giải đông trứng
thường được tiến hành qua 5 bước chính: (1) Đặt trứng vào dung dịch chất bảo
quản; (2) Làm lạnh xuống nhiệt độ dưới 0oC; (3) Bảo quản ở nhiệt độ dưới 196oC; (4) Làm ấm và giải đông trong dung dịch thích hợp; (5) Chuyển trứng vào
môi trường nuôi cấy. [5, 8, 28]
1.1.2. Mục tiêu của đông lạnh trứng
Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng
của trứng. Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những
bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do vậy, mục tiêu của
đông lạnh trứng bao gồm việc giảm thể tích vật chứa, giảm tính độc chất bảo
quản, tăng gradient nồng độ, thay đổi tỷ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích
(SA/V) của tế bào là nhằm giảm stress cho trứng trong quá trình đông lạnh. [5, 8]
Các phương pháp đông lạnh thông thường thực hiện quá trình khử nước rất
lâu, hình thành nhiều tinh thể đá, điều này làm giảm khả năng sống của trứng sau
giải đông. Chính vì vậy, mục tiêu của quy trình đông lạnh trứng nói chung và
đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa nói riêng là hoàn tất sự thủy
tinh hóa nội bào, loại trừ tinh thể đá cả trong và ngoài tế bào với tốc độ làm lạnh
cực nhanh nhằm duy trì khả năng sống, ngăn stress cho tế bào đồng thời lại phải
dễ dàng trong thao tác. [28]


7


khoảng 20000 – 25000oC / phút. [28, 33, 49]


8

Tổng quan

Thủy tinh hóa có thể được thực hiện theo hai cách: tăng tốc độ hạ nhiệt;
tăng nồng độ chất bảo quản. Chính vì hai phương thức đó, chất bảo quản đông
lạnh được sử dụng với một lượng tối thiểu (khoảng 1µl) nhưng nồng độ rất cao
và tốc độ làm lạnh thường dùng vào khoảng 15.000oC – 30.000oC /phút. [28]
Với quy trình đông lạnh sử dụng phương pháp làm lạnh cực nhanh, tế bào
đặt trong chất bảo quản (thường ở nhiệt độ phòng) có nồng độ rất cao trong
khoảng thời gian ngắn nhất có thể, trứng được chứa trong các dụng cụ chứa
chuyên biệt (straw, cryotop, cryoloop) có thể tích nhỏ, sau đó được nhúng trực
tiếp vào nitơ lỏng mà không thông qua quá trình hạ nhiệt từ từ. Sự khử nước
được thực hiện rất nhanh do nồng độ rất cao của chất bảo quản, đồng thời nhiệt
độ thấp của nitơ lỏng (-196OC) sẽ làm tế bào đông đặc nhanh chóng khiến nước
trong tế bào không kịp hình thành tinh thể đá gây tổn thương đến tế bào. [28, 49]
Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh
hóa cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong
phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước
bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn. Kết quả là không có sự hình
thành tinh thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn
thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra. [12, 14, 15, 28]
Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả đông lạnh cần lưu ý một số vấn đề sau:
-

Loại và nồng độ chất bảo quản đông lạnh sử dụng. Mỗi loại hóa chất bảo


bào có thể chịu được nồng độ chất bảo quản đông lạnh trong suốt quá trình thủy
tinh hóa. Vì thế, việc cân bằng giữa tốc độ làm lạnh cực đại với nồng độ chất bảo
quản tối thiểu là rất quan trọng. [16, 18, 28, 49]
Thành phần chính của môi trường đông lạnh gồm:
-

Chất bảo quản lạnh (Cryoprotectant additive _ CPA)

-

Chất bảo quản ngoại bào

-

Môi trường cơ bản: môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường
nuôi cấy có bổ sung 20% huyết thanh. [52]

1.2.4. Đông lạnh trứng trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa
Trứng trưởng thành ở hầu hết động vật có vú chứa thoi vô sắc bị trì hoãn ở
giai đoạn MII. Thoi vô sắc được tạo thành từ các vi ống liên kết với các nhiễm
sắc thể của mẹ (Aigner và cs., 1992). Lúc này trứng có nhân và tế bào chất
trưởng thành, thể cực thứ nhất bị đẩy ra, nhiễm sắc thể đặc lại và xếp trên mặt
phẳng xích đạo của thoi vô sắc. [19, 28]
Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng
sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số nhân tố. Về nhân tố hình thái,
trứng mất cumullus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên
khả năng sống của chúng sau rã đông. Trứng trưởng thành không đồng nhất trong
sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tương có thể ảnh hưởng đến kết
quả của quy trình đông lạnh. [28]
Trứng ở giai đoạn MII dễ bị tổn thương do đông lạnh vì thoi vô sắc nguyên

Năm 1997, Shinichi Hochi và cs. nghiên cứu khả năng thụ tinh của trứng bò
đông lạnh rã đông ở các giai đoạn chưa trưởng thành, đang trưởng thành và
trưởng thành. Đến năm 2003, nhóm nghiên cứu này báo cáo tỉ lệ trứng thụ tinh
sau rã đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst là 5%. [45]
Năm 2007, Gupta và cs. thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa bằng cách sử dụng
kết hợp EG và DMSO đối với trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện. Tuy
nhiên, chỉ 3,4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20,1%. [23]
Năm 2008, Morato và cs. đã đưa ra tỷ lệ IVF đối với trứng bò sau khi thủy
tinh hoá bằng vi giọt là 46,1% và 5,3% trứng bò phát triển đến giai đoạn
blastocyst. [37]
Năm 2010 nhóm nghiên cứu do Zhou XL và cs. thuộc Trường Đại học
Dublin, Ireland đã tiến hành IVF trên trứng bò trưởng thành được đông lạnh với


11

Tổng quan

tỷ lệ thụ tinh là 11,3% và 4% phát triển đến giai đoạn blastocyst [51]. Trong khi
đó nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Suranaree, Nhật Bản do Sripunya N
báo cáo tỷ lệ phân chia là 41,6% và có 10,3% phát triển đến giai đoạn blastocyst
khi tiến hành IVF từ trứng bò MII được thủy tinh hóa. [38]
• Tình hình nghiên cứu trong nước
Kỹ thuật tạo phôi từ trứng đông lạnh đã được ứng dụng vào Việt Nam từ
vài năm qua. Tuy nhiên chủ yếu áp dụng trên người, đi đầu là bệnh viện Từ Dũ
nhằm giúp hỗ trợ cho các đôi vợ chồng hiếm muộn. Các nghiên cứu và ứng dụng
kỹ thuật đông lạnh trong bảo quản trứng, mô, phôi trên động vật hữu nhũ ở Việt
Nam còn rất ít. [53]
Năm 2003, trường hợp thai lâm sàng đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng
người đông lạnh được thực hiện ở bệnh viện Từ Dũ. [53]

mổ hay sử dụng trứng đông lạnh. Theo Long và cs. (1993), các nang trứng có
đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc
thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF. Trong kĩ thuật
IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi
trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM). Ngoài ra, sử dụng trứng đông
lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển
phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng thụ
tinh của trứng trong quá trình bảo quản. [8, 28]
Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các trứng đã được thực hiện
với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông. Ở nhiều phòng thí nghiệm, do
khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho các
nghiên cứu IVF. Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành
phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng. Mục đích của các phương pháp
thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng bình
thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các chất
độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng. [13]
Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ
ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các
môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả
năng hoạt động của chúng. Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp
chúng duy trì khả năng thụ tinh. Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng
đến tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng. Martinez-Mardrid và cs. (2001) đã sử dụng hai


13

Tổng quan

môi trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi
trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh. Kết quả này cho thấy, trong


14

ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, người ta có thể quan sát được phôi ở giai đoạn 8 tế
bào. [28, 35]
• Giai đoạn phôi dâu (morula) và phôi nang (blastocyst): Sau ngày thứ 4 các
tế bào phôi bắt đầu mất dần ranh giới giữa chúng. Màng tế bào phôi trở nên khó
phân biệt, lúc này phôi có hình dạng và kích thước rất khác nhau giai đoạn này
gọi là giai đoạn nén (compaction). Ở giai đoạn này, phôi được gọi là phôi dâu.
Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khoang phôi (cavitation) khoảng 100 giờ sau
khi thụ tinh. Khoang phôi tích lũy dịch ngày càng nhiều và lớn dần, kích thước
của khối tế bào bên trong (Inner Mass Cell _ICM) trở nên nhỏ và bắt đầu nén
chặt, lớp tế bào nuôi phôi (Trophectoderm Cell _TE) cũng giảm dần kích thước
sau lần phân chia và dẹp hơn. Phôi ở giai đoạn này gọi là phôi nang khoảng ngày
thứ 6 đến 8 sau thụ tinh. [5, 8, 34, 35]

Giai đoạn 2 tiền nhân

Phôi 2 tế bào

Phôi 4 tế bào

Phôi 8 tế bào

Phôi dâu

Phôi nang

Hình 1.1. Các giai đoạn phát triển của phôi


được chính xác tỷ lệ tinh trùng thực sự được hoạt hóa. Do đó, để đảm bảo cho sự
thụ tinh thành công, tinh trùng thường được sử dụng với một lượng rất lớn.
Trong điều kiện nuôi cấy thông thường, mật độ tinh trùng vào khoảng 105-106 tinh
trùng/ml hoặc 104-105 tinh trùng/trứng. Tuy nhiên, điều này sẽ gây ra tỷ lệ thụ