BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


NGUYỄN THANH HOÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA
CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


NGUYỄN THANH HOÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA
CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ
tôi trong quá trình thực hiện những nghiên cứu trong luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị, các bạn ở phòng Sinh lý thực
vật, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM và các bạn trong lớp Cao
học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 20, đặc biệt là “ột” Thư đã động
viên, giúp đỡ tôi trong những lúc gặp khó khăn.
Và cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ông bà, bố mẹ, em trai và
“người dưng khác họ” thân thương đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên và hỗ trợ
tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.
Ngày 30 tháng 03 năm 2012
NGUYỄN THANH HOÀI


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM ....................................................4
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam ..............................................4
1.1.1.1. Phân loại............................................................................................4
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................4
1.1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái ..........................................................8
1.1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................9
1.1.2. Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam ....11
1.1.3. Tác dụng dược lý của sâm việt Nam .....................................................13
1.1.3.1. Bộ phận dùng làm thuốc .................................................................13
1.1.3.2. Tính năng và tác dụng dược lý........................................................14
1.1.4. Bảo tồn và nhân giống ...........................................................................14

2.2.3. Thí nghiệm 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong
nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi
cấy in vitro. .......................................................................................................48
2.2.4. Thí nghiệm 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. .50


2.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi
lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây
sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro........................................................................52
2.3. PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ LIỆU ................................................................53
2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ................................................55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................56
3.1. THÍ NGHIỆM 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí
sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS
có bổ sung NAA, IBA và TDZ. ............................................................................57
3.2. THÍ NGHIỆM 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và
cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng
phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro..............67
3.3. THÍ NGHIỆM 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi
cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in
vitro . .....................................................................................................................83
3.4. THÍ NGHIỆM 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. .......88
3.5. THÍ NGHIỆM 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng
và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt
Nam nuôi cấy in vitro. ..........................................................................................94
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................99
4.1. KẾT LUẬN..................................................................................................100
4.2. ĐỀ NGHỊ .....................................................................................................101

: cộng sự

IAA

: Acid indol-3-acetic

IBA

: Acid indolbutyric

GA

: Gibberellin

Kin

: Kinetin (6 – furfurylaminopurin)

MS

: Môi trường khoáng cơ bản do Murashige & Skoog đề xuất năm
1962.

MS1/2

: Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm một nửa

MS2/3

: Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm còn 2/3

Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử...................................................25

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm 1a. .................................................................................42
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm 1b. ................................................................................43
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm 2a. .................................................................................45
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 2b. ................................................................................45
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm 3a. .................................................................................48
Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm 3b. ................................................................................49
Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm 4. ..................................................................................50
Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm 5. ..................................................................................52
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị
trí tạo mô sẹo từ phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 ..
.............................................................................................................58
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị
trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ
56.

.............................................................................................................62

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ
lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84. ......
.............................................................................................................68
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ
đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84. .....
.............................................................................................................75
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CĐHSTTV và ánh sáng lên sự phát sinh hình thái từ
đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 35. .....
.............................................................................................................85




Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles). ............................13

Hình 1.7.

Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại Phòng
Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới.. .....................19

Hình 1.8.

Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì của rễ chính. ..........................................24

Hình 1.9.

Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây sâm Việt Nam in vitro ..............24

Hình 1.10.

Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella. ...........................................26

Hình 1.11.

Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.). .......................26

Hình 1.12.

Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ lá cây Phalaenopsis ‘Little Steve’.
.............................................................................................................27

Hình 1.13.

vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. ..............................................................40
Hình 2.2. Cây sâm Việt Nam nuôi cấy trong tủ điều khiển khí hậu Percival. .........40
Hình 2.3. Thân khí sinh và phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. ........43
Hình 2.4. Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam
in vitro. ................................................................................................47
Hình 2.5. Cách bố trí mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh trên đĩa petri. ..........47
Hình 2.6. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. .......................................51
Hình 3.1. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây
sâm Việt Nam in vitro. ........................................................................57
Hình 3.2. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm
Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56. ........................................................59
Hình 3.3. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây
sâm Việt Nam in vitro. ........................................................................61
Hình 3.4. Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị
trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có
2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ . .......................................................61
Hình 3.5. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt
Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy .....................................................63
Hình 3.6. So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh
của cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56. ....................................65
Hình 3.7. Chồi và rễ bất định hình thành trên đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt
Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy. ..................................................66
Hình 3.8. Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro
trên môi trường không có 2 mg l-1 NAA sau 9 tuần cấy chuyển. .......66


Hình 3.9. Hình thái mô sẹo và rễ hình thành từ lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt
Nam in vitro ở các vị trí khác nhau trên môi trường MS1/2 bổ sung 2
mg l-1 2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84. .....................................70
Hình 3.10. Rễ hình thành từ vị trí thứ 6 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in

Hình 3.23. Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm
thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy. ..............................................91
Hình 3.24. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. ..........92
Hình 3.25. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ
đường sucrose. .....................................................................................96


MỞ ĐẦU
Tại các nước châu Á, nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các vị
thuốc đông y “sâm nhung quế phụ”, là thuốc bổ tăng lực và có nhiều tác dụng dược
lý khác. Cây sâm Việt Nam là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới. Các
nhà khoa học Nhật Bản và Hàn Quốc đánh giá cao và xếp cây sâm Việt Nam vào
năm loại sâm quý nhất thế giới cùng với sâm Hàn Quốc, sâm Nhật Bản, sâm Mỹ,
sâm Trung Quốc. Một số nghiên cứu cho thấy số lượng và hàm lượng các
ginsenoside của sâm Việt Nam vượt trội hơn các loài sâm khác (Nguyễn Ngọc
Dung, 1995; Nguyễn Thượng Dong, 2007).
Hiện nay, sâm Việt Nam được bán trên thị trường với giá ngày càng cao, cao
hơn sâm Triều Tiên nhiều lần, dẫn đến tình trạng bị khai thác quá mức. Cây sâm
Việt Nam hiện nằm trong số 250 loài thực vật quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt
chủng trong Sách đỏ Việt Nam. Vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loài thực vật quý
hiếm này đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và là
nhiệm vụ vừa quan trọng vừa cấp bách về phương diện khoa học lẫn kinh tế, xã hội.
Trong thời gian qua, một số công trình nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng
cây sâm Việt Nam trong điều kiện tự nhiên đã được công bố, song kết quả thu được
còn nhiều hạn chế. Cây sâm trồng từ hạt sinh trưởng rất chậm và phải mất 5 – 7
năm mới tạo củ có hoạt chất. Hạt sâm gieo khoảng 6 tháng mới có thể nẩy mầm, tỷ
lệ nẩy mầm thấp, lại bị dịch bệnh, chuột bọ phá hoại, cây sâm cho hoa đậu hạt cũng
ít, một cây chỉ có 1 – 2 hạt mà sau 3 năm cây mới ra hoa. Do đó, nhu cầu về các kỹ


CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam
1.1.1.1. Phân loại
Theo Hoàng Thị Sản (2003), Đỗ Huy Bích và cs. (2004), cây sâm Việt Nam
được phân loại như sau:
Giới

:

Plantae

Ngành

:

Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp

:

Magnoliopsida

(Ngọc Lan)


(Thực vật)

Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.
Tên khác: Sâm Việt, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Sâm trúc, Sâm đốt trúc,
Trúc tiết nhân sâm, Củ ngải rọm con, Thuốc dấu (dân tộc Xê Đăng).
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây sâm Việt Nam là loài cây thân thảo đa niên (thậm chí trên 100 năm), cao
40 – 100 cm, sinh trưởng chậm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Cây sâm Việt Nam có hai loại thân là thân khí sinh (mọc trên mặt đất) và thân
rễ (nằm dưới mặt đất) (Hình 1.1a). Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, màu lục hoặc
hơi tím, nhỏ, đường kính 4 – 8 mm, thường tàn lụi hàng năm, thỉnh thoảng cũng tồn
tại vài thân trong vài năm. Lá của cây sâm Việt Nam thuộc loại lá kép chân vịt, mọc
vòng (Hình 1.1b). Cuống lá kép dài 6 – 12 mm, mang 3 – 5 lá chét ở ngọn thân khí
sinh, lá chét chính giữa lớn hơn cả với chiều dài lá 10 – 15 cm, chiều rộng 3 – 5 cm.
Phiến lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành
mũi nhọn, mép khía răng cưa nhỏ. Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp gân phụ
hình mạng. Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông tơ ở hai mặt, mặt
dưới ít hơn. Cây sâm Việt Nam từ 1 – 3 năm tuổi chỉ có một lá kép duy nhất, từ
năm tuổi thứ 4 trở đi mới có 2 đến 3 lá.


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam.
(a) Cây sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha et Grushv.; (b) Lá cây sâm Việt Nam
ở Tu Mơ Rông (Kon Tum); (c) Hoa; (d) Quả.
(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam; ; />

Cụm hoa được hình thành ở cây sâm Việt Nam trên 4 – 5 năm tuổi, mọc thành
tán đơn ở ngọn thân khí sinh, cuống hoa dài 10 – 20 cm, có thể kèm 1 – 4 tán phụ
hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính (Hình 1.1c). Mỗi tán có 60 – 100 hoa,
cuống hoa ngắn từ 1 – 1,5 cm, đài có 5 răng dài, hoa có 5 cánh, màu lục vàng với 5


1.1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái
Trong số hơn 10 loài đã biết của chi Panax, ở Việt Nam có ba loài mọc tự
nhiên và một loài là cây nhập trồng. Cây sâm Việt Nam là loài được phát hiện sau
cùng. Đến nay, cây sâm Việt Nam mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi
Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ
hai của Việt Nam, có toạ độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh độ Đông và từ 15o0’ –
15o10’ vĩ độ Bắc (Hình 1.3). Đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2.598 m. Những điểm
trước đây vốn có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1.500 – 2.200
m, chủ yếu tập trung ở độ cao 1.800 – 2.000 m thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô
(tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Ngoài ra, cây sâm Việt Nam còn
phân bố tại núi Ngọc Lum Heo (Quảng Nam), Đắc Glây (Kon tum),
núi Langbian (Lâm Đồng) (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

Hình 1.3. Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh.
(Nguồn: ; />

Cây sâm Việt Nam đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hay tập
trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng già; độ che phủ có thể tới 80% hoặc hơn.
Cây sâm chỉ chịu được cường độ chiếu sáng bằng 1/3 ánh sáng toàn phần. Môi
trường rừng có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt và thường xuyên có
mây mù. Nhiệt độ ban ngày từ 20 – 25°C, ban đêm 15 – 18°C, lượng mưa xấp xỉ
3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu
đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Trong cùng một quần thể
sâm Việt Nam có nhiều cây ở các lứa tuổi khác nhau, điều đó chứng tỏ cây sâm Việt
Nam có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Đỗ
Huy Bích và cs., 2004).
1.1.1.4. Thành phần hóa học
Cây sâm Việt Nam có hàm lượng saponin dammaran cao nhất (12 – 15%) và
số lượng các loại saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax. Trong đó,

chất mới là 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),
10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol.
Hợp chất steroid: β-sitosterol và daucosterin (β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranosid).


Acid béo: 14 loại trong đó có các acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid
linoleic và acid linolenic.
Acid amin gồm 18 loại (trong đó có đủ 8 loại acid amin không thay thế) như
acid aspartic, acid glutamic, alanin, arginin, cystin, glycin, histidin, isoleucin,
leucin, lysin, methionin, phenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrosin,
valin. Một số acid amin có tỉ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và
tryptophan 10,20% đã được xác định có khả năng chống lão hóa tế bào.
Nguyên tố đa lượng, vi lượng: 20 loại trong đó có K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe,
Co, Zn, Se có tác dụng sinh học.
Hợp chất glucid gồm đường tự do 6,19% và đường toàn phần 26,77%.
Các thành phần khác như tinh dầu 0,05 – 0,1%, vitamin C 0,059%.
b) Phần trên mặt đất (lá)
Hợp chất saponin có 19 saponin dammaran đã được phân lập gồm 11 saponin
đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8.
+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol.
+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol.
+ Các saponin có cấu trúc ocotillol chỉ có một loại saponin chính là
Vinaginsenoside-R 1 (0,155%).
1.1.2. Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam
Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, cây sâm Việt Nam đã
được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc
Xê Đăng sử dụng để chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Năm
1973, khu Y tế Trung Trung Bộ cử một tổ 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim Long làm
trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần
Thanh Dân đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc