i
ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN
XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN
Tác giả
ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
Cấp bằng Kỹ sư ngành
Công nghệ hóa học Giáo viên hướng dẫn
Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH
Th.S LÊ XUÂN TIẾN
Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN
Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn
xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụ
ng trong lĩnh vực dược
phẩm.
Tiến trình thực hiện đề tài như sau:
1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid
- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội).
- Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy,
xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiế
t >95% và có
thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiế
p theo.
2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine
– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC),
2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy.
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổIR, MS, NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2
dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt
tính sinh học.
iv
3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin
– Hoạt tính kháng ung thư.
– Hoat tính kháng oxy hóa.
– Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
– So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt
2.1.1. Curcuminoid .......................................................................................................... 4
2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid .............................................................. 4
2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid .......................................................... 5
2.1.2. Curcumin ............................................................................................................... 6
2.1.2.1. Lý tính ................................................................................................................. 6
2.1.2.2. Hóa tính .............................................................................................................. 7
2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. ................................................... 14
2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư
...................................................................................... 15
2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa ...................................................................................... 16
2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur .................................................... 17
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23
3.1. Sơ đồ thực nghiệm .................................................................................................. 23
3.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 24
3.2.1. Phân lập curcumin ................................................................................................ 24
vi
3.2.1.1. Kết tinh lại ........................................................................................................ 25
3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ................................................................................... 26
3.2.1.3. Sắc ký cột ......................................................................................................... 27
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. ........................................................... 29
3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin .................................... 29
3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin ................................ 32
3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp .............................................. 35
3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). ...................................................................... 35
3.2.3.2. Phổ hồng ngo
ại (IR) ......................................................................................... 35
3.2.3.3. Khối phổ .......................................................................................................... 35
3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................................................ 35
3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................................ 35
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 62
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 62
5.2. Kiến nghị. ............................................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 67 viii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : Curcumin
DMC : Demethoxycurcumin
BDMC : Bisdemethoxycurcumin
HC : Hydrazinocurcumin
IOZ : Isoxazolcurcumin
HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin
DFPHC : 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
OD : Mật độ quang
HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá
CS : là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được
thử tính theo % so với chất đối chứng
IC
50
: Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư
hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)
IC
70
: Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư
vào
pH môi trường.
................................................................................................................ 12
Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin
.................................... 12
Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch
................................................................... 13
Hình 2.10: Phức Cur với kim loại
........................................................................................ 13
Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do
....................................................................... 14
Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u
....................... 16
Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur
...................................................... 17
Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC
....................................................................................... 18
Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC
.................................................................................... 18
Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư
khác
nhau (theo phương pháp MTT)
............................................................................................ 18
Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN
............ 19
Bảng 2.4 : Giá trị IC
50
của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC
................ 20
(M=368).
.......................................................................... 45
Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng
........................................................................................ 46
Hình 4.8: Sắc ký cột thô
........................................................................................................ 47
Hình 4.9: Sắc ký cột tinh
....................................................................................................... 47
Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH
2
Cl
2
:CH
3
OH: 97:3 v/v)
...... 48
Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C
28
H
23
SN
3
O
4
(M=497)
.................................................. 49
Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng
......................................................................
Hình 4.13: Sắc ký cột thô
xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
.......................................................... 4
Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid
.......................................... 5
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur
......................................... 7
Bảng 2.4 : Giá trị IC
50
của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC
................ 20
Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại
...................................................................................... 25
Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi
......................................................................... 26
Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH
............................................................ 36
Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh
......................................................... 41
Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur
..................................................................... 44
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin
........................................................................ 45
Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC
................................................................. 48
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC
............................................................................. 49
xii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu.
........................................................ 23
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin
............................................................................. 24
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC)
................. 29
Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC)
.......... 32
1
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ lâu curcumin đã được biết đến như là một hoạt chất có nguồn gốc từ thực
vật đóng vai trò quan trọng trong nền công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.
Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng tỏ curcumin có nhiều hoạt tính sinh học quan
trọng như: kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng nhiều chủng tế bào ung thư, chống đột
biến, giả
m cholesterol, chống đông máu, chữa được một số bệnh như: Alzheimer, đái
sau:
a. Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin.
– Phân lập curcumin từ bột curcuminoid.
– Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm
chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
b. Tổng hợp và xác
định cấu trúc của các dẫn xuất
– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC)
2,4 - Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập các sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ MS, IR và NMR.
c. Khảo sát các hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất
imine - curcumin
–
Hoạt tính kháng ung thư.
– Hoat tính kháng oxy hóa.
Theo phương pháp DPPH.
Theo phương pháp MDA.
– Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
– So sánh các hoạt tính của dẫn xuất tổng hợp được với hoạt tính sinh học
của curcumin.
3
1.4. Yêu cầu
– Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết.
– Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.
– Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin.
1
OH
R
2
Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7]
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]
Hợp chất R
1
R
2
CTPT M (đvc)
Cur OCH
3
OCH
3
C
21
H
20
O
6
368
DMC OCH
3
H C
20
H
18
O
:MeOH (95:5 v/v ).
G. K. Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid
bằng sắc ký cột silica gel. Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi
benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42
v/v). Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175
- 176, 231 - 232
o
C.
W. Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao
ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl
3
,
sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH
3
OH. Thu được các phân
đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC).
L. Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính
chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt. Hỗn hợp curcuminoid (Merck)
được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH
2
Cl
2
:CH
3
OH (5:1 v/v), hiệu suất quá
trình kết tinh ~ 40%.
Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ
silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH
2
PO
2.1.2.1. Lý tính
Có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi [6].
Tỉ trọng: 0.93 g/ml [5].
Điểm chảy: 179- 183
0
C [5].
Bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng. Khi ở dạng dung dịch Cur dễ bị phân
hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ [6].
7
Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng
và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở
25
0
C) [6,12].
Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong
môi trường acid có màu đỏ tươi [4].
Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ
420 - 430 nm [6].
2.1.2.2. Hóa tính
a. Quá trình điện ly theo pH
Cur không tan trong môi trường nước ở pH acid và trung tính nhưng tan tốt ở
pH kiềm [12]. Nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC cho kết quả điện ly theo pH của Cur
như sau:
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồ
n tại của Cur [12].
pH Màu của dung dịch Dạng ion tồn tại
< 1 Đỏ H
4
A
8
H
3
A
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO
H
2
A
-
OHHO
OCH
3
H
3
CO
O
-
O
Phân hủy trong môi trường kiềm
Cur tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng
trong môi trường kiềm [12]. Ở pH = 8.5, chỉ sau 5 phút Cur đã bắt đầu phân hủy thành
ferulic acid và feruloylmethane. Sau đó, feruloylmethane còn bị phân hủy thành
vanillin và acetone. 9
OCH
3
OCH
3
OH
HO
OO
OCH
3
HO
O
OCH
3
OH
O
HO
OH
-
OH
-
OCH
3
hoặc 3 phân tử H
2
tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và
hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO
2
) tương
ứng (hình 2.5), các
sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [15].
+ H
2
Ni (PtO
2
)
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO
n = 1: dihydrocurcumin
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO
2
), hydroxylamine (NH
2
OH), hydrazine (NH
2
-NH
2
), semicarbazide
11
(NH
2
NHCONH
2
) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương
ứng [2,3,16,17].
Cơ chế phản ứng imine hoá
RC
O
Y
R'NH
2
RC
O
-
Y
+NH
2
+
Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16]
Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên
tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm
carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành
hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation
ammonium. Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian
bền hơn là carbinolamin. Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho
cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh
ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn
tách proton, hình thành sản phẩm là imine hoặc các dẫn xuất của imine [2,16].
Trong cơ chế của phản ứng imine hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan
trọng. Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amine bị proton hoá. Các amine
bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không ph
ản ứng với các nhóm ketone.
Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imine. Điều
kiện pH thích hợp cho phản ứng imine hoá là khoảng pH~4.5 [17]. Hình 2.7 mô tả sự
phụ thuộc của tốc độ phản ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường
phản ứng.
Hìn
hyd
xuất i
nghiên
Cur. C
nh 2.7: S
droxylamine
Cur cũng
imine, Cur
hợp chất dị
ứng này tươ
Isoxa
Pyra
trúc của dẫ
ốc độ phả
[17].
one nên ng
ợp chất dị v
vòng của C
ơng tự như p
NO
azole curcum
NHN
azole curcum
ẫn xuất isox
ản ứng (k
goài khả nă
vòng khác
Cur như dị
phản ứng im
min
min
xazole và py
k
obsd
) gi
ữ
hỗ biến keto-enol đối xứng và ổn định, làm cho Cur có khả năng tạo phức mạnh với
nhiều ion kim loại khác nhau như : Zn
2+,
Sn
2+,
Al
3+,
Cu
2+,
Ni
2+,
Fe
3+
...[4].
CH
R R
O O
H
H
C
R R
O O
H
Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch [5]
Các ion kim loại này hấp thu các cặp electron trong nguyên tử oxy của phân tử
Cur để tạo phức. Phức ion-kim loại không bền ở nhiệt độ cao và khi tiếp xúc với ánh
sáng trong thời gian dài. Một ion kim loại có thể tạo phức với một hay nhiều phân tử
Cur.
O O
Copyright: Tài liệu đại học ©