ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
TÁCH VÀ TINH CHẾ DẪN XUẤT CURCUMIN
TRÍCH LY TỪ CỦ NGHỆ VÀNG
(Curcuma longa L.) SVTH : NGUYỄN THỊ MẠC PHƯỢNG
CBHD : PGS TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
ThS. PHAN THỊ HOÀNG ANH
KS. LÊ XUÂN TIẾN
được thông qua Bộ môn Ngày………tháng ……năm 2007 Ngày………tháng ……năm 2007
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
TS. Phan Thanh Sơn Nam ThS. Phan Thị Hoàng Anh
PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ):
Đơn vị:
Ngày bảo vệ:
Điểm tổng kết:
Nơi lưu trữ luận án:
i
phương pháp TLC, CC, HPLC.
2. Xác định độ tinh khiết, cấu trúc và một số tính chất hóa học của các
curcuminoid phân lập được.
Khảo sát hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid và ba thành phần curcuminoid
pheo hai phương pháp DPPH và MDA. Kết quả tất cả các mẫu đều có hoạt tính sinh
học trong hai phép thử này.
iii
LỜI MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, ở các nuớc Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nuớc Đông Nam Á,
nghệ đã được sử dụng như môt loại gia vị truyền thống và một loại thuốc gia truyền sử
dụng trong gia đình. Nghệ được biết đến là một loại cây có tác dụng dược lý rất tốt
chữa nhiều bệnh khác nhau. Curcuminoid là một hỗn hợp gồm ba dẫn xuất
diferuloylmethane đã
đuợc nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh là thành
phần chủ yếu đem lại hoạt tính sinh học của củ nghệ. Hoạt tính của các curcuminoid
thành phần có thể khác nhau và khác với curcuminod hỗn hợp. Do vậy, việc tách các
thành phần này ra khỏi hỗn hợp là cần thiết cho việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính
dược học của nghệ.
Nội dung đề tài luận văn này xin trình bày việc tách chiết các curcuminoid thành phần
từ
bột curcuminoid thương phẩm và khảo sát cấu trúc, tính chất hóa học cũng như hoạt
tính kháng oxy hóa của các đơn thành phần, đem đến hiểu biết sâu hơn về curcuminoid
và khả năng ứng dụng các thành phần của curcumioid trong thực phẩm và dược phẩm.
Bảng 3.10. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcumin theo phương pháp DPPH
Bảng 3.11. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, DMC và BDMC theo
phương pháp DPPH
Bảng 3.12. Hoạt tính bắt gốc tự do của trolox theo phương pháp DPPH
Bảng 3.13. Giá trị IC
50
của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC
Bảng 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid thô, curcumin, DMC và BDMC
theo phương pháp MDA
Bảng 3.15. Hoạt tính bắt gốc tự do trolox theo phương pháp MDA
Bảng 3.16. Giá trị IC
50
của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC
v
DANH SÁCH CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cây nghệ
Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone
Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin
Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH
Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin
Hình 1.9. Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do
3
Cl:CH
3
OH
Hình 3.2. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH
2
Cl
2
:CH
3
OH
Hình 3.3. Kết quả TLC của các mẫu hỗn hợp curcuminoid ban đầu (M) và hỗn hợp
curcuminoid sau lần kết tinh thứ nhất (I), thứ hai (II) và thứ ba (III)
Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp curcuminoid: (A)ban đầu; (B) sau kết tinh
Hình 3.5. Kết quả TLC của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của curcumin, DMC, BDMC
Hình 3.7. (A) curcumin; (B) demethoxycurcumin (DMC); (C) bisdemethoxycurcumin
(BDMC)
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của curcumin
Hình 3.9. Phổ UV-Vis của DMC
Hình 3.10. Phổ UV-Vis của BDMC
Hình 3.11 Curcumin C
21
H
20
O
6
(M=368)
Hình 3.12: Demethoxyurcumin C
20
MS : phổ khối lượng (Mass spectrometry)
IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
UV-Vis : phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – visible spectroscopy)
IC
50
: Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective
concentration 50)
Oleoresin : nhựa dầu
Chương 1: Tổng quan
1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về curcumin
Curcumin là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma longa L) – một loài cây phân
bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Á và được dùng như một loại gia
vị. Curcumin có dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của
nghệ.[6]
Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn con người ngay cả
với lượng lớn. Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người với lượng lên tới
10g /ngày. [2]
Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành
dược. Curcumin đã được sử dụng trong thuốc truyền thống để chữa các bệnh như :
bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm [5].
Trong những năm gần đây, người ta rất quan tâm đến nhiều tác dụng dược lý khác của
curcumin nh
ư: tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng virus, chống đông máu…[2]
H
H
O
CH
3
O
H
O
CH
3
O
H
O
H
3
C
O
H
O
O
H
O
CH
3
H
H
O
O
H
3
theo là DMC (17%) và BDMC (3%). [14]
O
O
OH
OH
R
1
R
2
1)
R
1
= R
2
= OCH
3
: Curcumin (Cur)
2)
R1 = OCH3 ; R2 = H : Demethoxy curcumin (DMC)
3)
R1 = R2 = H : Bis-demethoxy curcumin (BDMC)
Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
Mỗi thành phần kể trên còn có các đồng phân hình học: s-cis-diketone, s-trans-
diketone, cis-cisenol. Ngoài ba thành phần chính ở trên, mỗi thành phần nhỏ còn có
thể chia thành các thành phần nhỏ hơn là các đồng phân hình học của chúng.
Curcumin tồn tại ở 3 dạng đồng phân: cis-diketone, trans-diketone và enol.
phẳng và cho phép cộng hưởng bên trong 2 phần benzene. Kết quả là curcumin dạng
enol thể hiện một mũi hấp thu mạnh ở vùng nhìn thấy. Ngược lại, cấu trúc của dạng
ketone lại xoắn nên hấp thụ ở vùng tử ngoại g
ần [2].Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone.
Dạng đồng phân enol có 3 proton có thể ion hóa tương ứng với 1 nhóm enolic và 2
nhóm phenolic. Khi phân ly, dạng enol phân ly thành 2 loại anion. Một loại hình thành
do sự phân ly proton của nhóm enolic có bước sóng hấp thu cực đại là 429 nm và loại
kia do sự phân ly proton của nhóm phenolic có bước sóng hấp thu cực đại là 531 nm.
[2]
Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin.
Enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và enolic proton có tính acid trội nhất
trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá trình phân ly và
trao đổi proton liên quan đến cơ ch
ế loại bỏ gốc tự do của curcumin. Điều đó có nghĩa
là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu
tiên tách ra. [2]
(1)
(2)
O
H
3C
H
O
O
H
O
2
.-
HO
2
.
Và trong cơ chế SPLET (Sequential proton loss electron), curcumin đầu tiên chuyển
sang dạng monoanion bằng cách tách enolic proton. [2]
H
3
CO
O
H
C
O
H
H
O
OCH
3
O
H
+H
+
-H
nghệ (turmeric) có thể vẫn tồn tại trong curcumin. Đó là các sesquiterpene ketone và
các alcolhol như : α-turmeron, β-turmeron, curlon, zingiberen, ar-turmeron,
turmenorol A, turmeronol B ...[3]
1.1.2. Tính chất hóa lý của curcumin
1.1.2.1. Tính chất vật lý [6]
Curcumin được trích từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L., có dạng bột màu
vàng, điểm chảy 184-185
°
C.
Curcumin là chất màu tan trong dầu, ethanol, methanol, dichloromethane,
acetone, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid và trung tính, tan
trong môi trường kiềm.
Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng
khoảng từ 420 – 430 nm.
1.1.2.2. Tính chất hóa học
a. Sự điện ly
Trong môi trường pH <1, curcumin có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa H
4
A
+
. Ở
pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa H
3
A, có khả năng
hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng. Ở pH > 7.5, màu dung dịch chuyển sang
đỏ. Giá trị hằng số phân ly pK
a
của 3 proton dạng acid của curcumin ( dạng H
2
Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH.
b. Phản ứng với H
2
Do có nối đôi ở mạch carbon nên curcumin có khả năng phản ứng cộng với H
2
với xúc
tác PtO
2
.
H
4
A
+
H
3
A
H
2
A
-
HA
O
-
OH
H
3
CO
O
O
-
OCH
3
O
-
O
-
H
3
CO
O
OH
OCH
3
O
-
Chương 1: Tổng quan
6
OH
H
3
CO
3
H
O
tetrahydrocurcumin
OH
H
3
CO
O
OH
OCH
3
OH
hexahydrocurcumin
Trong đó tetrahydrocurcumin (THC) cũng là một chất có hoạt tính chống oxy hóa có
khả năng loại bỏ gốc tự do như gốc tert-butoxyl và peroxyl. [7]
c. Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm
Curcumin tương đối bền ở pH acid nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy ở pH kiềm.
Đầu tiên ferulic acid và ferulolylmethane được tạo thành. Sau đó, eruolylmethane
nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến vàng nâu. Tiếp theo,
eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và aceton và lượng các chất này tăng
theo thời gian ủ. [3]
Chương 1: Tổng quan
7
OH
OCH
3
O
O
curcumin và bền nhất là BDMC. Kế
t quả HPLC cho thấy sản phẩn phân hủy của quá
trình này là: vanillin, ferulic acid, feruolylmethane và trans-6-(4-hydroxy-3-
methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal.
d.
Phân hủy dưới tác dụng ánh sáng
[3]
Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch[3]. Curcumin bị phân
hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn. Sản phẩm phân hủy là vanillin,
vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid. [11]
OH
‐
OH
‐
Sản phẩm ngưng tụ
Chương 1: Tổng quan
8
Khi bị chiếu xạ, curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillic acid, vanillin và
ferulic acid ( Sasaki et al, 1998)[3].
Khi có mặt của oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và
vanillin:
OH
H
3
CO
O
O
dụng cho phản ứng tạo phức là muối acetate, clorua, nitrate, sulfate, carbonate của các
kim loại chuyển tiế
p như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg. [15] Các phức
này cũng có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược. [14]
H
3
CO
OH
C
OCH
3
OH
O
O
Cu
OH
2
H
3
CCOO
H
3
CO
OH
C
OCH
3
OH
O
O
OCH
3
OH
R*
-H
+
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
O
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
O
H
3
CO
O
O
OH
Curcumin
Hình 1.9 Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do [13].
1.1.3. Phương pháp phân lập 3 thành phần của curcumin
Như đã đề cập ở phần trên, curcumin trên thị trường là hỗn hợp của 3 curcuminoid:
curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC).
Trong đó curcumin chiếm chủ yếu (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC
(3%) [14]. Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và
tính chất hóa học khác nhau. Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DMC và
BDMC vẫn ch
ưa có trên thị trường. Do đó, việc tách các curcuminoid thành những
đơn chất riêng biệt là cần thiết cho việc nghiên cứu và có ý nghĩa kinh tế. Nhiều
nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp nhằm phân lập các thành phần này trong hỗn
hợp curcumin thô ban đầu.
Rasmussen và các đồng sự [15] đã đưa ra phương pháp tách các curcuminoid đơn giản
và hiệu quả sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) silica gel đã được tẩm dihydrogen
phosphate. Tuy phương pháp này có thể tách và xác định các curcuminoid thành phần
nh
ưng vẫn còn hạn chế do không định lượng được hàm lượng mỗi curcuminoid có
trong hỗn hợp.
Chương 1: Tổng quan
10
Marsin [4] đã sử dụng phương pháp HPLC CO
2
siêu tới hạn với pha động là hệ đệm
acetonitrile/acetate [4]. Một phương pháp khác của Xian-Guo He là tách và xác định
curcumin sử dụng cột Supelcosil LC-18 với pha động là ammonium acetate/ acetic
acid và acetonitrile[16]. Taylor và McDowell đã tách được 3 thành phần curcuminoid
sử dụng cột polymer non-silica với pha động là dung dịch acetonitrile 55%.
tương ứng là 0.55, 0.50, 0.43. Các
chất này cũng cho một mũi đơn trên HPLC. Nhiệt độ nóng chảy đo được của curumin,
DMC và BDMC tương ứng là 186 -187, 175 -176 và 231 - 232
°
C [4]. Bằng phổ
1
H và
13
C NMR, các curcuminoid này được xác định tương ứng là curcumin, DMC và
BDMC. Các kết quả trên chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid có
oleoresin nghệ và khẳng định đó chính là curcumin, DMC và BDMC.
Péret-Almeida và các đồng sự [1] đã tách được và xác định một số tính chất hóa lý của
từng curcuminoid riêng biệt. Nghiên cứu đã khảo sát một số hệ dung môi để tách 3
thành phần trên bằng sắc kí bản mỏng silica gel 60G (Merk, Darmstadt, Germamy)
(4.5 x 10 mm).
Chương 1: Tổng quan
11
Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC [1]
TLC mobile phases
R
f
Curcumin DMC BDMC
Toluene:ethyl acetate (97:3) 0.9 0.86 0.8
Toluene:ethyl acetate (90:10) 0.84 0.8 0.75
Chloroform:methanol (95:5) 0.4 0.34 0.25
Dichloromethane:methanol (99:1) 0.47 0.28 0.16
Dichloromethane:methanol (95:5) 0.53 0.42 0.33
Dựa vào giá trị R
môi dùng để rửa giải là dichloromethane. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được
gom lại thành các nhóm dựa vào kết quả chạy TLC.
Chương 1: Tổng quan
12
Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối
lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg) [1]
Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần
Khối lượng
(mg)
14-1 1120 C 31.2
15-17 240 C , DMC 4.14
18-30 960 DMC 30.97
31-33 240 DMC, BDMC 3.88
34-47 1120 BDMC 31.06
Độ tinh khiết của các curcuminoid riêng lẻ được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng
cao HPLC và xác định điểm chảy. Kết quả phân tích HPLC cho các peak đơn chứng tỏ
nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid thành các đơn chất tinh khiết. Kết quả
đo điểm chảy của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là 184, 172 và 222
°
C
[1].
Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin. [1]
Các curcuminoid thu được còn được định tính bằng phổ các phổ tử ngoại, phổ khả
kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp đo màu. Các kết
quả đo đã xác định các chất thu được chính là curcumin, DMC và BDMC.
Chương 1: Tổng quan
13
Chương 1: Tổng quan
14
Hình 1.11. (A) Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, các mẫu từ trái sang lần lượt là hỗn
hợp các curcuminoid: curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC
(curcumin III). (B) Kết quả HPLC của các chất theo thứ tự từ trên xuống: hỗn hợp
các curcuminoid, curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin
III). (C) Cấu trúc của các curcuminoid xác định được curcumin (curcumin I),
DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) [18]
1.2. Hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất curcuminoid
Từ xa xưa, ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á, nghệ (Curcuma
longa L.) đ
ã được sử dụng làm gia vị, chất bảo quản và màu thực phẩm. Nghệ còn là
vị thuốc trong gia đình để chữa các bệnh khác nhau: rối loạn mật, chứng biếng ăn, ho,
viêm gan, xoang … Những thập niên gần đây, người ta ngày càng chú ý nhiều đến
hoạt tính sinh học của nghệ và curcumin. Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và
tác dụng dược lý của curcumin. Kết quả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học
mạnh và đa dạ
ng, bao gồm: hoạt tính chống viêm, chống ung thư, chống đột biến,
chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm
cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS
… [6, 22]
khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát
triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thu
ộc
vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24].
1.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa
Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính
sinh học mạnh và đa dạng. Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy
hóa của curcumin. Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh. Các nghiên
cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác
nhân gây oxy hóa (ROS) nh
ư: anion superoxide, H
2
O
2
, gốc nitrite đồng thời làm giảm
lượng ROS in vivo. Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và
bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22]
Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa
mạch đều có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều
tranh cãi xung quanh việc hoạt tính của curcumin thực chất do hydrogen ở vị trí nào
đem lại.
Liang Shen [2] cho rằng enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và là proton có
tính acid trội nhất trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá
Tế bào
bình thường
Tế bào
ung thư
Khối u tăng
trưởng
Khối u di
O
H
O
O
H
O
2
.-
HO
2
.
Wei-Feng Chen [25] đã nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’-azobis(2-amidinopropane
hydrochloride) (AAPH) và Cu
2+
trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin
và một số chất có cấu trúc tương tự curcumin nhưng cấu tạo không có nhóm phenol.
Các chất đó là: 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4-
methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-
dione (3). Kết quả hoạt tính của các chất này yếu hơn curcumin. Do đó, nhóm nghiên
cứu đã kết luận rằng nhóm phenol trong phân tử đóng vai trò quan trọng trong hoạt
tính kháng oxy hóa của curcumin
.
(2)
O
O
OCH
3
H
3
CO
(3)
O
O
Copyright: Tài liệu đại học ©