Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
MỤC LỤC
Phạm Khánh Dung ..................................................................................................................3
NỘI DUNG..............................................................................................................................4
I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1.........................................................................................4
I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm....................................................................................4
I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1............................................................................................4
I.3. Dịch tễ học.................................................................................................................7
I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1......................................................10
I.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm typ A và phòng chống bệnh...........................15
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu........................................................................25
II.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................25
II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.....................................................................25
KẾT LUẬN............................................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................35
1
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thuỷ
cầm, đặc biệt là ở gà. Dịch bệnh này do các phân typ khác nhau thuộc nhóm
virus cúm typ A, họ Orthomyxoviridae gây nên (Dybing et al., 2000; Hatta
et al., 2001). Khi dịch bệnh xuất hiện thì rất dễ bùng phát thành đại dịch
nguy hiểm.
Hàng năm trên thế giới có khoảng 10.000- 20.000 người tử vong vì
bệnh cúm, đặc biệt là vụ dịch năm 1918-1919 có khoảng 21 triệu người chết
(Couch, Kasel, 1995). Nhiều công trình đã chứng minh rằng virus cúm typ A
là nguyên nhân gây ra những vụ đại dịch nguy hiểm và điều này được giải
thích bằng khả năng thay đổi kháng nguyên HA- hemagglutinin (H1

đến
H15) và kháng nguyên NA- neuramindaza (N1 đến N9), sự tổ hợp của

Phạm Khánh Dung
3
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
NỘI DUNG
I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1
I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh viêm đường hô hấp cấp
tính rất nguy hiểm, với khả năng lây nhiễm cao, có nhiều biến chủng khác
nhau, thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và có hệ gen luôn biến đổi. Đây
là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type
khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt
virus (de Wit, Fouchier, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ
H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp
(reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra
nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác,
virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen
(đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau,
trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Họ
Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là: nhóm
virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus
cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi
các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin
(HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở
Thogotovirus là Glycoprotein (GP).
I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1
I.2.1. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
Virus cúm typ A đã gây ra những vụ dịch kinh hoàng trong lịch sử:
Đại dịch cúm Tây Ban Nha vào năm 1918 đã gây chết trên 20 triệu người,
tiếp theo đó là những đại dịch nhưng ít nghiêm trọng hơn như: đại dịch cúm
1957 gọi là dịch cúm Châu Á do phân typ H2N2 gây nên, đại dịch cúm năm

được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành
virus của người.
I.2.2. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các
tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên
dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia
cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến
nay (tháng 10/2008), dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại
nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như
sau:
Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở
các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ
trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà
và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17%
tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu
con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc
thiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và
cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này.
Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17
tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng
11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống
kê trong vụ dịch này là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt;
6
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
và 19.950 con chim cút. Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm
A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong.
Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra
trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y
thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000

phạm gây ra các vụ đại dịch, các virus cúm typ B thường gây ra các dịch khu
vực. Nhiều công trình nghiên cứu đó chứng minh rằng virus cúm typ A cú
khả năng biến đổi không ngừng, tạo ra những phân typ virus mới là nguyên
nhân của các vụ đại dịch cúm. Nguyên nhân của sự biến đổi không ngừng có
thể được giải thích như sau:
Khi cơ thể bị nhiễm virus cúm sẽ sinh không thể chống lại virus ở
mức độ khác nhau. Do vậy virus thay đổi không ngừng để tồn tại.
Virus cúm typ A thích ứng tồn tại trên người và nhiều loài động vật
như vịt, gà, lợn, ngựa, chim… nên các loài này luôn là nguồn tàng trữ virus.
Chính vì vậy, sự lan truyền nội, ngoại loài tạo cơ hội cho các biến chủng trao
đổi gen và tái tổ hợp tạo nên những biến chủng mới.
Bệnh cúm lây trực tiếp từ người sang người bằng đường hô hấp, qua
các hạt nước bọt nhỏ li ti mang rất nhiều virus. Ngày nay các phương tiện
giao thông hiện đại làm cho dịch cúm không những lan tràn nhanh trong
phạm vi địa phương mà còn cả trong phạm vi toàn cầu.
Mọi người, mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với cúm, đặc biệt là trẻ em, lứa tuổi
thanh thiếu niên và phụ nữ mang thai. Người già, người có bệnh mạn tính
đường hô hấp dễ bị nhiễm cúm nặng, có nhiều biến chứng và tỷ lệ tử vong
cao.
I.3.1. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H5N1
Sinh bệnh học
Virus cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp thông
qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào được trong tế bào biểu
mô đường hô hấp, virus nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào để
chui ra và xâm nhập vào các tế bào lành khác.
8
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virus cúm bị các yếu tố miễn dịch
không đặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng, dịch phế nang và IgA tiết …
chống lại. Khi virus cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm

Nhóm Thogotovirus
Hạt virion có dạng hình cầu, đôi khi ở dạng sợi, đường kính khoảng 80-
120nm, trọng lượng phân tử của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton.
Hệ gen là sợi ARN đơn âm, được ký hiệu là ss(-) ARN, kích thước hệ gen
thường 10.000-15.000 nucleotide và có cấu trúc phân thành 8 phân đoạn,
mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các
protein chức năng của virus. Lõi virus mang vật liệu di truyền và 3
polymerase, PB1, PB2, PB3 đều được gắn với nucleoprotein dạng xoắn
helica, phức hệ này tạo thành nucleocapsid. Bao quanh nucleocapsid là lớp
protein nền (matrix protein), ký hiệu là M
1
, tiếp đó là màng lipid kép có
10
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
nguồn gốc từ tế bào vật chủ. Lớp vỏ virus có bản chất là lipoprotein, bao
gồm những gai mấu có bản chất là protein trần hoặc đã được glycosyl hoá
gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương tác kỵ nước, kích thước của những
gai mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-6nm. Có khoảng 500 gai mấu
chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin), gai NA (neuraminidase).
a b
a- Hình thái của virut cúm typ A; b- Cấu trúc hạt virion của cúm typ A
I.4.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng
Virus cúm typ A có hệ gen là ss(-) ARN mang 8 phân đoạn, mỗi phân
đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein cấu
trúc hoặc không cấu trúc của virus.
Phân đoạn 1, 2, 3: mã hoá cho các protein PB1, PB2, PB3. Những
protein này có chức năng là các ARN polymerase phụ thuộc vào ARN cần
cho quá trình tổng hợp mARN và ARN hệ gen của virus.
Phân đoạn 4: mã hoá cho protein HA. HA là các gai mấu có bản chất
là glycoprotein, nằm rải rác trên bề mặt của virus cúm gây ngưng kết hồng

lệ cao nhất trong virion, với chức năng chính là làm ổn định hình thái của
virion. Protein nền này cũng mang kháng nguyên đặc hiệu typ, qua đó được
sử dụng để xác định virus cúm typ A, B, C.
Phân đoạn 8: là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural
protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước
khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP,
nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng
virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy, Webster, 1996; Sekellick et al.,
2000). Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-
structural gen) này được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 (Webster, 1998),
trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc
lực (Zhu et al., 2008). NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.10
3
Da
(trên thực tế là 25.10
3
Da), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của
virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận
chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2,
là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có
khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.10
3
Da (trên thực tế là 12x10
3
Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm
để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick et al., 2000; Zhu et al.,
2008).
Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn
riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện
12

13
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
cúm H3N2 ở người là kết quả của sự tái tổ hợp gen H2N2 ở người và H3
của virus trong tự nhiên; H7N7 của hải cẩu có thể do sự tái tổ hợp gen của 2
hay 3 loại virus cúm ở chim; H1N1 và H3N2 phân lập năm 1978 và năm
1989 gây bệnh ở người có cấu trúc protein bề mặt được lấy từ nguồn gen tái
tổ hợp từ H1N1 hoặc H1N2 và 4-6 gen có nguồn gốc từ H3N2.
Các chủng virus cúm phân lập được, được qui định danh pháp theo
trình tự như sau: typ huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời
gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA và NA. ví dụ:
A/chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1) là chủng virut cúm typ A phân
lập trên gà tại Việt Nam, ký hiệu chủng là HD1, năm phân lập là năm 2004,
có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1.
I.4.4. Chu trình sinh sống của virus cúm typ A
Virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cơ chế ẩm bào nhờ tương tác
đặc hiệu giữa kháng nguyên HA và thụ thể là axit sialic trên màng tế bào vật
chủ. Khi pH môi trường trong khoang ẩm bào thấp, sẽ diễn ra sự dung hợp
giữa lớp vỏ lipoprotein của virus và lớp kép lipit của thể endosome, giải
phóng RNP (ARN và các protein PB1, PB2, PB3 được bao bọc bởi
nucleoprotein) vào tế bào chất của tế bào vật chủ, sau đó được chuyển vào
trong nhân. Tại đây chúng sử dụng bộ máy của hệ thống vật chủ và enzym
ARN polymerase phụ thuộc vào ARN do virus mang theo để tổng hợp nên
mARN thông tin, mARN sau khi trải qua cải biến cắt bỏ intron, được adenyl
hoá ở đầu 3’ sẽ được chuyển ra tế bào chất để tiến hành dịch mã tạo các
protein cấu trúc hoặc không cấu trúc, hầu hết các protein được tổng hợp ở lại
trong nguyên sinh chất, số khác lại được chuyển vào trong nhân để tiếp tục
quá trình tổng hợp nguyên liệu di truyền và tham gia vào quá trình bao gói
vật liệu di truyền. ARN đơn âm được chuyển thành ARN đơn dương theo cơ
chế bổ sung, và sợi dương này lại làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN đơn
âm mới nhờ ARN polymerase phụ thuộc vào ARN vừa được tổng hợp.