Enzyme trong công nghệ thực phẩm
Nhóm 1 – 49k hoá thực phẩm gồm các thành viên :

1. Hoàng Thị Phương Anh 0852049105
2. Nguyễn Thị Bảy 0852040449
3. Đinh Thị Quỳnh Bé 0852045283
4. Nguyễn Thị Chung 0852045298
5. Lê Thị Dung 0852040456
6. Nguyễn Thị Dung 0852040434
7. Nguyễn Cảnh Dũng 0852049081
8. Trần Anh Dũng 0852040452
9. Lê Thị Duyên 0852040429
Mở đầu
Từ trước thế kỉ 17, loài người chưa biết gì về enzyme, người ta đã biết sử dụng rộng
rãi các quy trình enzyme trong thực tế như làm bánh mì, bia, rượu, muối dưa… Việc
sử dụng enzyme trong giai đoạn này mang tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử
dụng enzyme thông qua hoạt động sống.
Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như:
chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế… Hàng năm luợng enzyme được sản
xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD,được phân phối
trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn
cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân
được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin. Nó được sản xuất chủ yếu
bởi nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme,
Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa…
Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm
đặc biệt được sử dụng nhiều nhất trong sản xuất nước quả , sản xuất rượu vang, trích
ly đông dược ( sắc thuốc ), và trong chăn nuôi...

oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định
các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp,
chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và các
nhóm acetyl.
- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được
ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid là
polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có
chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid. Pectate là muối
của pectic acid.
- Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học
phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các
ion Ca
2+
, Mg
2+
, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy
phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan.
Protopectin (Insoluble ) + H
2
O
⇒
Pectin (Soluble )
1.1.2 Enzyme pectinase:
Hình 2 : cấu trúc phân tử pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin. Sự phân hủy
pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có
một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
1.2 Phân loại enzyme pectinase
Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia làm 2 nhóm chính : hydrolase,
transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và

α
1-4
– galacturozit – metyl este
glucanhydrolase ). PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt
liên kết
α
1,4
ở trong hay ở cuối và đầu mạch.
•
Endo glucozidase polymetyl galactunase kiểu I ( endo- PMG – I ). Đây là enzyme
có tính chất dịch hóa , pectin có mức độ metyl hóa càng cao ( nhiều gốc metoxy –
OCH
3
) thì bị thủy phân càng nhanh và triệt để. Trong môi trường khi có mặt
pectinesterase ( PE ) thì enzyme này càng bị giảm hoạt lực.
Endo – PMG – I rất phổ biến trong các nấm mốc : Asp , Niger , Asp.Awamori,
Botrytis cinezea , Neurispora crassa.
Cơ chế tác dụng như hình vẽ :
•
Exo - glucozidase polymetyl galacturonase kiểu III ( exo- PMG – III ). Đây là
enzyme có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monome axit galacturonic
ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có nhóm metoxy (-OCH
3
)
Cơ chế tác dụng như hình vẽ :
+ Enzyme tác dụng lên axit pectinic hay axit pectit - gọi là polygalacturonase ( PG )
cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ :
•
Endo glucozidase polygalacturonase kiểu II ( endo- PG – II ). Đây là enzyme có
tính chất dịch hóa, chỉ thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm –COOH tự do. Hoạt độ

enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh
sạch.
Bảng 1 : So sánh enzyme nội bào và enzyme ngoại bào
Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào
Khó tách Dễ tách
Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung với các chất khác
của tế bào sau khi bị phá vỡ (acid
nucleic, chất nguyên sinh, lipid….)
Không lẫn chung với các thành phần
nội bào, nếu có chỉ là một vài
enzyme ngoại bào khác.
Chỉ bền vững ở trong môi trường nội
bào.
Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch khó thực
hiện, quy trình công nghệ phức tạp,
giá thành đắt
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn.
1.3.2 Thu nhận enzyme pectinase
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có 2 phương pháp sản xuất
pectinase :
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
1.3.2.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo hay
cám mì, bã củ cải hay thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là amonium,
photphoric. Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60% .
Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30
0

42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm
lượng chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trưòng lỏng. Cô đặc chân không
canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt từ 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy
phun , điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt từ 165-180
0
C và đi
ra đạt 60-70
0
C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun không
quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không quá 40
0
C. Chế phẩm thu được cần
phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu được chế phẩm enzyme pectinase
tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ
4:1, với axeton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1.3:1, hoặc với muối amoni
sunfat ( 50-80% ) trong muối kết. Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectin trong kết
tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa
bằng muối amoni sunfat. Cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích
(với nước hoặc dung dịch đệm ), sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của (NH
4
)
2
SO
4
=0.5
thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp( đoạn này chiếm 0.25% trọng
lượng khô ). Nhưng nếu kết tủa bằng (NH
4
)

0
C.
Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase.
Thành phần môi trường gồm có : (NH
4
)
2
HPO
4
0.4% , KH
2
PO
4
0.3%, K
2
HPO
4
0.7%
, NaCl 0.1% , MgSO
4
0.025% , FeSO
4
dạng vết, CaCO
3
0.5%, dịch nấm men tự phân
0.05%, ascorbic axit 0.5% .
Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với
dung môi hữu cơ hoặc với muối amoni sunfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH
của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích axeton thì hoạt độ
của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban ban đầu.

nhưng PE2 tích lũy dần cho trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối
lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7.6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở
67
0
C. Các ion Ca
2+
và Na
+
làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ
0.005M và 0.05M theo thứ tự. PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử
33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần bằng 8. Polygacturonic acid, sản phẩm hình thành
do quá trình đề methyl hóa, là một chất ức chế cạnh tranh.
- Trong thịt quả chuối có 2 isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là
30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau : 8.8 và 9.3. Các enzyme này hoạt động ở
pH tối ưu là 7.5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ
0.2M và đưa pH của dung dịch về 6.0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại
polyol có khối lượng phân tử thấp như glycerol, sucrose, glucose, maltose và
galactose.
PE trong quả cam có hai loại : Đó là 2 enzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử
36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10.05 và
≥
11.0 theo thứ tự. pH tối ưu
của PE1 là 7.6 , còn của PE2 là 8.0.
- Thịt quả cũng chứa 2 isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn,
còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi tác động của protease. Độ ổn định của
enzyme có thể liên quan đến mức độ của glucosyl hóa của các phân tử enzyme.
Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme kia có khối lượng là 51kD và 36kD theo thứ tự.
- Cả táo và kiwi cũng chứa 2 isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối
lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7.3. Tuy nhiên chúng khác nhau về
mức độ bền nhệt. Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme vi sinh vật đều không phải là

Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể liên
quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh
tranh trong phản ứng thủy phân nhờ xúc tác của PE. Pectin chứa các nhóm
cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự. Sự liên
kết của các ion kim loại vào các nhóm cacboxylate trong trường hợp này có khuynh
hướng trung hòa ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên, lượng
dư của các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây
quanh bởi các nhóm cacboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản
ứng thủy phân xảy ra.

2.1.2 Vi sinh vật
Nhiều vi sinh vật sống trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin. Chúng có
ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn 2 cacbon trong tự nhiên mà
còn đối với một số ngành sản xuất trong công nghiệp.
Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất :
+ Nấm mốc : Asp. ficuum, Asp.niger, Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.terrus, Asp.saitoi,
Pen.glaucum, Pen.chrlichii, Mucor mucedo, Rhizopus tritici,…
Trong số các biến chứng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và Asp.awamori.
+ Nấm men: Sac.fragilis, Sac.ellipsoideus, Sac.ludwigii,…
+ Vi khuẩn : Bac.polymyxa, felseneus, Clostridium roserum, Pseudomonas flurescens..
Tất cả các vi sinh vật dùng để thu enzyme pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí.
Đặc điểm phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật :
Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau : có cơ thể chỉ
tạo được một enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme
pectinase khác nhau mà tùy theo loài.
- Sac.fragilis : chế tạo ra duy nhất 1 loài enzyme phân giải pectin dải nhất là
endo-polygalacturonase.
- Các nấm mốc Asp.niger, Asp.awamori, Asp.foelidus, Asp.saitoi… thường tạo ra được
một phức hệ enzyme pectinase khác nhau.

Giống Asp.Niger được nuôi cấy trên môi trường có nhiều nguồn các bon như pectin ,
tinh bột, isulin, lactose, saccarose, mantose, galactose nồng độ 2, 4, 6 % sẽ cho
pectinase có hiệu suất cao. Tuy nhiên nên nuôi cấy trên môi trường chỉ có
monosaccarit và glyxerin thì hoàn toàn không thể sinh tổng hợp này. Đường glucose
có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp enzyme pectinase trên môi trường nuôi cấy là
pectin và lactose đối với loài Asp.Niger , Asp.Awamori
Nguồn cacbon ở
trong môi
trường
pH cuối
Khối lượng sợi
nấm khô(g)
Hoạt độ pectinase đơn vị
Trên 100ml môi
trường
Trên 100g sợi
nấm khô
Pectin 2%
Pectin 4%
Lactose 2%
Lactose 4%
Saccarose 2%
Saccarose 4%
Lactose 2% +
Pectin 2%
Saccarose 2% +
Pectin 2%
5,9
6,0
7,0

2.1.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nếu dùng kết hợp nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ có tác động tốt đến quá trình sinh tổng hợp
pectinase. Tuy nhiên, muối nitrat kim loại kiềm lại kìm hãm enzyme này.
Ví dụ:
- Đối với Asp.niger thì sử dụng muối photphat diamon ( NH
4
H
2
PO
4
) để sinh tổng
hợp enzyme pectinase tốt nhất.
- Đối với Asp.awamori thì nguồn nitơ thuận lợi nhất là amoni sunphat (NH
4
)
2
SO
4
- Đối với nấm mốc Asp.Foetidus thì (NH
4
)
2
SO
4
, nước chiết nấm men có tác dụng
nâng cao hoạt lực polygalacturonase.
- Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hoá
đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme pectinase tốt hơn.
Nói chung, tỉ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng
7/1 – 13/1.

2
HPO
4
NaNO
3
NH
4
NO
3
Pepton
Dịch thuỷ phân
casein
1,200
0,890
0,850
1,500
1,550
1820,7
880,6
810,9
1620,0
1350,0
0,491
0,197
0,163
0,418
0,340
0,560
0,310
0,278

0,320
0,500
0,530
Bảng 3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ
2.1.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Ngoài nguồn C, N, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo
thành phức hệ enzyme này. Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường.
Hàm lượng P trong môi trường phải là 8-10%. Khi sử dụng nguồn N của phốtphát
diamon thì nhu cầu về P của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn. Các yếu tố khác như
pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh
hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase.
2.1.3 Môi trường lên men giống
• Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek.
• Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60
o
C cho đến khi độ ẩm
cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)
• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm:
 Cám gạo 65,5%
 Trấu 21,5%
 Bột cà rốt 11%
 (NH
4
)
2
SO
4
2%
 Độ ẩm 55%.
2.2 Sơ đồ công nghệ


Tinh chế kết tủa

Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết

Enzyme kết tinh
Thuyết minh quy trình :
+ Nguyên liệu được trộn với nhau.
+ Làm ẩm : có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của
môi trường cám là 58-60%. Khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì
đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi làm ẩm 65-68%. Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm
thì sẽ bị dính bết ( khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy ), dễ bị nhiễm vi sinh vật
tạp ( bị lên men rượu, lên men giấm…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên
liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng
( nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội ) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên
liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác
hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn.
+ Thanh trùng bằng hơi nhiệt :
Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín
( biến hình ) môi trường ( tinh bột, protein ). Thông thường người ta thanh trùng bằng
hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-130
0
C trong 2-3 giờ.
+ Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống :
Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy phải làm nguội và làm
tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy. Yêu cầu
thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu đạt
được để gieo giống là 35-39
0
C.

C cần thông gió ( quạt ) và bão hòa
ẩm không khí phòng nuôi.
- Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều
nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi
nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo. Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi
mấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử.