TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGUYỄN THỊ LÝ HẰNG
LT08175
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME PECTIN METHYLESTERASE
TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG
TỪ Aspergillus niger
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 2010
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME PECTIN METHYLESTERASE
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lòng biết ơn đến thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn
thành bài luận văn tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô trong
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức
cũng như những kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình học tập tại Trường.
Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã
tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị cao học, đặc biệt là chị Mai Thiên Hương đã
giúp đỡ và truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quí báu trong suốt thời gian thực hiện luận
văn.
Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm đã hỗ trợ, góp ý và cùng tôi học tập, chia sẻ
những kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập tại Trường.
Chân thành cảm ơn!
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
ii
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
TÓM LƯỢC
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1 Giới thiệu chung ............................................................................................... 3
2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase..................................................................... 3
2.1.2 Cấu trúc của pectin methylesterase............................................................. 4
2.1.3 Trung tâm hoạt động của PME................................................................... 5
2.2 Tính chất và kiểu hoạt động của pectin methylesterase ..................................... 5
2.2.1 Tính chất.................................................................................................... 5
2.2.2 Cơ chế hoạt động thủy phân ....................................................................... 6
2.3 Nguồn tổng hợp pectin methylester từ vi sinh vật.............................................. 6
2.4 Hoạt độ enzyme ................................................................................................ 7
2.4.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ...................................................... 7
2.4.2 Đơn vị hoạt độ enzyme .............................................................................. 8
2.4.3 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme ............ 9
2.4.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme ........................................ 10
2.5 Sản xuất pectin methylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger......................... 10
2.5.1 Giới thiệu sơ lược về giống vi sinh vật ..................................................... 10
2.5.2 Môi trường nuôi cấy................................................................................. 11
2.5.3 Cơ chất cảm ứng (pectin) ......................................................................... 12
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy chìm (phương pháp nuôi cấy bề sâu) .................... 14
2.5.5 Thu nhận enzyme ..................................................................................... 15
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methylesterase.. 16
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
iv
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
v
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân pectin của PME ................................................................. 3
Hình 2.2 Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do................................................. 3
Hình 2.3 Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi, cà chua và cà rốt.................... 4
Hình 2.4 Trung tâm hoạt động của PME cà rốt, cơ chất là đơn vị acid methyl-ester Dgalacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động.......................................................... 5
Hình 2.5 Sự thủy phân pectin dưới sự xúc tác của PME.............................................. 6
Hình 2.6 Hình dạng nấm Aspergillus niger............................................................... 10
Hình 2.7 Mô tả vách tế bào thực vật ......................................................................... 12
Hình 2.8 Cấu tạo pectin…. ....................................................................................... 13
Hình 3.1 Máy khuấy từ gia nhiệt .............................................................................. 23
Hình 3.2 Tủ cấy........................................................................................................ 23
Hình 3.3 Máy chuẩn độ acid-bazơ 785 TITRINO ..................................................... 23
Hình 3.4 Thiết bị thanh trùng Autoclave................................................................... 23
Hình 3.5 Tủ ủ ........................................................................................................... 24
Hình 3.6 Máy lắc ..................................................................................................... 24
Hình 3.7 Máy vortex................................................................................................. 24
Hình 3.8 Cân điện tử................................................................................................. 24
Hình 3.9 Qui trình thí nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme pectin methylesterase...... 27
Hình 4.1 Mẫu sau khi thanh trùng............................................................................. 31
Hình 4.2 Chế phẩm enzyme thô................................................................................ 31
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật. Hơn nữa enzyme có nguồn gốc
tự nhiên không độc và giúp cho các phản ứng xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 - 1011
lần tạo ra sự tiện lợi tối đa trong quá trình sản xuất nên được ứng dụng rộng rãi trong
chế biến thực phẩm.
Nghiên cứu sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme đã được phát triển mạnh từ thế kỷ
XX đến nay. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh
vực như: công nghiệp, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… trong số đó, ngành công nghiệp
thực phẩm là lĩnh vực có lượng tiêu thụ enzyme nhiều nhất.
Đối với một nước nông nghiệp như Việt Nam thì việc ứng dụng enzyme vào ngành
công nghiệp thực phẩm là một vấn đề cần được quan tâm. Và enzyme pectin
methylesterase được xem là enzyme then chốt trong quá trình sản xuất các sản phẩm
từ rau quả. Đặc biệt enzyme pectin methylesterase (PME) có tác dụng to lớn trong
ngành công nghiệp đồ uống như sản xuất rượu vang, sản xuất nước quả và nước uống
không có cồn, sản xuất nước giải khát, sản xuất cà phê và cà phê hòa tan…
PME có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Tổng hợp enzyme từ vi sinh
vật là sự lựa chọn hàng đầu so với từ động vật và thực vật do có nhiều ưu điểm:
- Tốc độ sinh sản mạnh
- Enzyme thu được có hoạt tính cao
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme từ vi sinh vật rẻ tiền và dễ kiếm, đôi khi
chỉ là phế phẩm của một số quá trình sản xuất
- Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp
- Một loại vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
Với hi vọng đề ra được một qui trình sản xuất theo qui mô công nghiệp nguồn enzyme
có hoạt tính cao nhưng giá thành thấp và có thể đáp ứng được nhu cầu của thị trường
trong nước cũng như xuất khẩu, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase trên môi trường
lỏng từ Aspergillus niger”
2.1 Giới thiệu chung
2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase
Pectin methylesterase thuộc nhóm enzyme pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy
phân pectin. PME còn có tên khác là pectinesterase (PE) và được đánh số trong hệ
thống phân loại là EC 3.1.1.11. Chúng thủy phân pectin tạo thành acid pectinic hoặc
acid pectic và methanol bằng cách tấn công vào các nhóm ester methyl (-COOCH3)
của đơn vị galacturonate nằm cạnh đơn vị không bị ester hóa (-COOH) (Hình 2.1 và
Hình 2.2). Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98% (Ly Nguyen, 2004).
PME
2H2 O
Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân pectin của PME
Pectine esterase
O
OH
OH
O
OH
O
O
O
OH
OH
OH
Pectine esterase
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
O
O
OH
CO OH
CO O H
3
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
2.1.2 Cấu trúc của pectin methylesterase
Cấu trúc bậc I của PME
Cấu trúc bậc I của PME là cấu trúc dạng chuỗi thường gặp ở thực vật như: PME từ cà
chua (Hình 2.3), cà rốt, khoai tây,… Chuỗi acid amin của các PME tương đối giống
nhau và các acid amin tại trung tâm hoạt động thì cố định gồm: hai acid aspartic,
arginine, hai glutamines và hầu hết các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp
phản ứng. (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; D’Avino et al., 2003)
Cấu trúc bậc II của PME
Cấu trúc bậc II của PME là dạng cấu trúc β-helix. Đây là cấu trúc vòng xoắn có gấp
nếp β-helix theo hướng phải, bao gồm 3 chuỗi β-sheet song song, và có những đoạn
dạng vòng được kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu giống như khe
nứt. Khe nứt thường tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và hai gốc aspartic tương
ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002;
D’Avino et al., 2003).
PME cà chua
PME cà rốt
PME E. Chrysanthemi
Hình 2.3 Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi, cà chua và cà rốt
(www.biochemj.org)
Hình 2.4 Trung tâm hoạt động của PME cà rốt, cơ chất là đơn vịacid methyl-ester Dgalacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động
(Jonhanson et al., 2002)
2.2 Tính chất và kiểu hoạt động của pectin methylesterase
2.2.1 Tính chất
PME phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của D-galacturonic.
Pectin methylesterase sẽ thủy phân nhóm methylester giữa 2 nhóm carboxyl tự do
trước, sau đó sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester theo phân tử pectin, kết quả của
quá trình thủy phân là tạo ra acid pectinic, acid pectic và methalnol (Hình 2.5).
Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật khử ester của pectin từ đầu khử hoặc không
khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi
đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Phản ứng khử ester bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự
do hay từ đầu khử của mạch acid polygalacturonic (chỉ tác dụng tại một vị trí trên
mạch), kết quả tạo thành các gốc galacturonic bị khử nhóm ester (Solms and Deuel,
1955). Bởi vì hoạt động cần có nhóm carboxyl tự do trên mạch polygalacturonic nên
PME từ thực vật ít hoạt động trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có
độ ester hóa từ 20% - 30% (Evans and Machale, 1978; Seymour et al., 1991).
Pectin methylesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm
ở giữa hai nhóm cacboxyl tự do. Và enzyme sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester
dọc theo phân tử pectin.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
5
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
PME của nấm mốc thủy phân pectin và các ester của acid polygalacturonic sâu sắc
Đại học Cần Thơ
- Hoạt tính enzyme được tổng hợp từ vi sinh vật cao hơn hoạt tính enzyme được tổng
hợp từ động vật và thực vật. Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và
tốc độ tăng sinh khối của vi sinh vật.
- Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.
Ta có thể thiết lập và kiểm soát các yếu tố thích hợp, đáp ứng được yêu cầu của một
quá trình sản xuất công nghiệp.
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme từ vi sinh vật rẻ tiền và dễ kiếm, đôi khi
chỉ là phế phẩm của một số quá trình sản xuất. Chính vì thế enzyme được sản xuất ra
có giá thành thấp hơn enzyme từ các nguồn khác. Điều này có ý nghĩa lớn về mặt
kinh tế và cả về mặt môi trường sống.
- Ngoài ra, một loại vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
PME từ vi sinh vật có khối lượng phân tử từ 27,8 - 40 kDa. Các loại vi sinh vật có khả
năng tổng hợp PME gồm: nấm mốc: Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P.
Chrysogenum, P. expanam, P. cilrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A.
terrus, A. saitoi…; nấm men: Saccharomyces fragilis…và vi khuẩn: Bacillus
polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes...
PME từ nấm mốc
PME thường được thu nhận từ các loại nấm sợi. PME từ nấm mốc là các loại enzyme
ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu 30 - 450C và bị vô hoạt ở
nhiệt độ lớn hơn 550C. pH tối ưu của nấm mốc trong khoảng 3,0 - 5,5. PME từ các
loài Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng
acid. Hoạt động của PME từ Aspergillus niger đạt tối đa ở pH 5,5 và nhiệt độ 400C.
Trong khi pH tối ưu của PME từ Aspergillus sp. là 3,7 - 4,2 và PME từ Aspergillus
sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
PME từ vi khuẩn
Cùng có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng PME từ vi khuẩn không có tính acid mà lại
có tính hơi kiềm. pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7 - 8 và hầu hết bị vô hoạt ở
sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
- Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự
biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong,
2008).
2.4.2 Đơn vị hoạt độ enzyme
Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế
(hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961 (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong,
2008). Đơn vị hoạt độ của một enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc tác
làm chuyển hóa được một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian nhất
định ở điều kiện tiêu chuẩn. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Đơn vị IU (đơn vị quốc tế): là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được
một micromol (1µM) cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 IU = 1µM cơ chất (10-6 M)/ phút
(Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Đơn vị Katal (kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ
chất sau thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat = 1 Mol cơ chất/ giây
Và
1 U = 1/60 microkat = 16,67 nkat
(Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Hoạt độ riêng:
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
8
để tránh sự thay đổi pH trong quá trình phân tích. Một số đệm (như đệm phosphate)
có thể làm kết tủa một số yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+,
vì vậy phải lựa chọn loại đệm thích hợp cho phân tích.
- Trong phân tích hoạt độ enzyme, cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt
độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng. Với các phân tích đồng thời
nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng của tất cả các mẫu phải được duy
trì như nhau.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
9
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
2.4.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme
Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ cơ
chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng do
enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho biết được các vấn đề sau:
- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme.
- Hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme.
- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các đơn vị
hoạt động enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của
enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng.
- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì cần kiểm tra về
mặt lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chế phẩm enzyme trong các
giai đoạn tinh chế.
(Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2008)
kính. Cuống thể bình phần lớn 5 - 6 x 20 - 30 µm, đôi khi 6 - 10 x 60 - 70 µm. Thể
bình 3,0 - 3,5 x 8 - 10 µm. Bào tử trần hình cầu, phần lớn 4 – 5 µm đường kính, ráp
hoặc có gai không đều, thành chuỗi gốc non.
Nấm Aspergillus niger khi mọc trên môi trường Sabouraud agar phủ đầy lông tơ và
đầy bột, ban đầu có màu trắng, chuyển dần sang màu nâu và trở thành màu đen đến
đen huyền. Vách của những cuống bào tử đính nhẵn. Xung quanh vách bào tử đính
màu nâu, hình thành những chuỗi hạt.
Hình dạng và kích thước: Đầu của bào tử đính có hình cầu hoặc hình cột tùy theo tuổi.
Kích thước: trên 3 mm x 15 – 20 µm. Bào tử đính có hình cầu. Kích thước: 3,5 - 5,0
µm.
Aspergillus niger có hoạt tính khác nhau ở những chủng khác nhau. Giống mốc này
có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thích hợp 30 - 330C.Vùng phân bố của nấm
Aspergillus niger rất rộng do có thể sinh trưởng trên nhiều cơ chất khác nhau như: các
loại ngũ cốc, quả chín, da động vật phân hữu cơ và trên một số loại nhựa.
Môi trường dùng nuôi cấy nấm Aspergillus niger thường là ba loại môi trường sau:
- Môi trường Czapek dox agar
- Môi trường Sabouraud agar
- Môi trường Potato dextro agar
2.5.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase bắt buộc phải có mặt chất cảm ứng pectin.
Ngoài ra, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào
quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào
sinh vật. Môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme
lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia, vì
vậy cần phải chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích
hợp với từng chủng. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm thường là môi trường lỏng
và được sục khí liên tục. Thành phần dinh dưỡng chính của môi trường lỏng gồm:
- Nguồn cung cấp cacbon: chủ yếu lấy từ các loại đường dễ đồng hóa như: glucose,
fructose, maltose, saccharose,... dịch thủy phân cellulose, tinh bột... Ngoài ra có thể từ
Cơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình
sinh tổng hợp enzyme. Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy với liều lượng tăng
dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng sẽ tăng dần, đến một lúc nào đó quá trình
này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất
gây nên. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao nhất ở
một liều lượng xác định nên cần sử dụng cơ chất cảm ứng với liều lượng thích hợp.
Nếu vượt quá nồng độ tối đa cho phép thì khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm.
Cơ chất pectin:
Hình 2.7 Mô tả vách tế bào thực vật
(www: micro.magnet.fsu.edu)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
12
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
Pectin là một thành phần quan trọng của vách tế bào thực vật (Hình 2.7) chủ yếu ở
lớp giữa vách tế bào sơ cấp của hầu hết các mô thực vật bậc cao. Pectin là một
polymer mạch thẳng được tạo thành từ các phân tử acid galacturonic liên kết với nhau
bằng liên kết α-1,4-glucoside (Hình 2.8). Khối lượng phân tử của pectin từ 80000 200000 (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
Pectin thương mại có hàm lượng acid galacturonic thường hơn 75% và độ ester hóa từ
30 - 80 % (Ly Nguyen, 2004). Pectin hòa tan trong dung dịch amoniac, dung dịch
kiềm, cacbonat natri và trong glycerin nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng
lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin
giảm (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa sẽ tạo gel đặc trong dung dịch
acid và trong dung dịch đường có nồng độ cao (khoảng 60 - 65%). Enzyme pectinase
tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học
không đồng dạng. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)
- Acid pectinic: Acid pectinic là acid polygalacturonic có mức độ ester hóa trung bình
bằng các nhóm methanol. Muối của acid pectinic là pectinate. (Nguyễn Đức Lượng et
al., 2004)
- Acid pectic: Acid pectic là acid polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm
methxyl, trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid
galacturonic. Muối của acid pectic là pectate. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy chìm (phương pháp nuôi cấy bề sâu)
Khác với quá trình trao đổi chất ở động vật và thực vật, quá trình trao đổi chất ở vi
sinh vật trong một giới hạn môi trường nhất định được gọi là quá trình lên men. Trong
quá trình lên men, vi sinh vật tham gia quá trình tổng hợp enzyme. Quá trình tổng hợp
enzyme thường xảy ra liên tục cả trong điều kiện yếm khí và trong điều kiện hiếu khí.
Trong công nghiệp enzyme hiện nay, người ta thường áp dụng quá trình nuôi hiếu khí
để thu nhận enzyme. Hiện nay có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận
enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao đổi
chất trong lòng môi trường. Vi sinh vật hiếu khí chỉ sử dụng được oxygen hòa tan
trong môi trường, vì vậy trong quá trình nuôi cấy phải sục khí và khuấy liên tục. Sự
sục khí không những ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng
đến sự tạo thành enzyme. Khuấy trộn có tác dụng phân phối tế bào vi sinh vật đều
khắp trong môi trường, đồng thời tạo điều kiện cho vi sinh vật tiếp xúc với chất dinh
dưỡng, cơ chất. Khả năng tiếp xúc càng nhiều vi sinh vật phát triển và sinh sản càng
mạnh, khả năng sinh tổng hợp emzyme càng cao. Trong quá trình khuấy trộn, oxy có
trong không khí trên bề mặt môi trường sẽ được hòa tan vào môi trường cho vi sinh
vật sử dụng (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004). Tốc độ sử dụng oxygen cao nhất của
nấm mốc sau khoảng 24 giờ nuôi cấy rồi giảm dần. Sinh tổng hợp enzyme theo
phương pháp nuôi cấy chìm thường khoảng từ 2 - 4 ngày. Đa số các enzyme thủy
phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước
có trong môi trường.
Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay, không cần qua
quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch
enzyme. Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi
trường, chúng ở dạng tinh thể, ta thu được chế phẩm enzyme sạch. Sau đó có thể dùng
các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol, muối trung tính để có chế
phẩm enzyme ở dạng sạch hơn. Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện di, lọc
gel… ta có thể tách từng phần để có enzyme tinh khiết hơn. (Đỗ Quý Hai và Trần
Thanh Phong, 2008)
Để thu nhận được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được
trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amonium sulfat.
Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa pectinase có thể là ethanol. Dung môi hữu cơ có
tác dụng làm giảm hệ số điện môi của môi trường thì protein và enzyme bị kết tủa.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm
15
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010
Đại học Cần Thơ
Khi kết tủa bằng ethanol thì lượng ethanol sử dụng phải gấp 3 - 4 lần dịch chiết
enzyme, nên khuấy đều để phân phối ethanol trong dung dịch. Khi có kết tủa thì lọc
hoặc ly tâm để thu kết tủa, rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 - 3 lần để tách bớt nước
trong kết tủa và sau đó đem sấy kết tủa. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)
Ngoài ra, cũng có thể dùng muối trung tính là amonium sulfat để kết tủa enzyme vì độ
hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến
tính enzyme, enzyme thu được có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu được bằng
16
Copyright: Tài liệu đại học ©