TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
_______***_______

LÊ THỊ MINH PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG
NẤM MỐC ĐƢỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH
PHÚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Phƣơng Phú Công

HÀ NỘI - 2010


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS. Phương Phú Công
đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hiện và
hoàn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong bộ môn Vi
sinh vật.
Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CMC

: Carboxylmethyl cellulose

M3

: Mẫu 3

M6-1

: Mẫu 6-1

M5-3

: Mẫu 5-3

Cx

: Endoglucanase

C1

: Exoglucanase

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính cellulase.......................... 34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ............... 35
Hình 3.8. Khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M3 và
Aspergillus M6-1 trên nguồn nitơ là NaNO3 ...............................................................................36

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1.1. Các thành phần chính của ligno – cellulose và các enzyme
phân giải của nấm ....................................................................................... 3
Bảng 1.2. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu ............................ 6
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose................. 26
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase .................................. 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase .......................... 31
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase .... 33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase............... 35

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2


Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.3.1. Hóa chất....................................................................................... 23
2.1.3.2. Thiết bị ........................................................................................ 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 23
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................ 23
2.2.2. Phương pháp hóa sinh...................................................................... 24
2.2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm ....... 24
2.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên
môi trường thạch (William, 1983) ............................................................. 24
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của
cellulase ................................................................................................... 25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose .......... 26
3.2. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase của chủng M3 và M6-1 ............................................................... 30
3.2.1. Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase ................................ 30
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase......................... 31
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase .......... 33
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase..................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

giá thành cao nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme để ứng dụng
trong chăn nuôi là vấn đề rất cần thiết.
Từ những lý do trên tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi
trƣờng ảnh hƣởng tới khả năng sinh cellulase từ một số chủng nấm mốc
đƣợc phân lập ở Vĩnh Phúc”.

Lê Thị Minh Phƣơng

1

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh
hƣởng tới khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc đƣợc phân
lập ở Vĩnh Phúc’’ nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy của một số chủng
nấm mốc để sinh cellulase nhiều nhất.
3. Nội dung của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh
cellulase ở huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc).
- Thử hoạt tính cellulase của một số chủng nấm mốc phân lập được.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng
sinh tổng hợp cellulase của một số chủng nấm mốc.
+ Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase.
+ Anh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase.

liền với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các thành phần chính của ligno - cellulose và các enzyme
phân giải của nấm (Fengel và Wegener, 1989; Eaton và Hale, 1993)
Cellulose

Hemicellulose Lignin

% sinh khối

40 – 50

25 – 40

Đơn phân tử

D – anhydrogluco Xylose

Coniferyl alcohol

pyranose

Mannose

ρ – counmaryl alcohol

Hexoses

Sinapyl alcohol

20 – 35

chính liên quan

(E. C. 3.2.1.4)

(E.C. 3.2.1.8)

(E.C. 1.11.1.7)

Lê Thị Minh Phƣơng

3

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

đến phân giải

Cellobiohydrolase và hydrolases

Mn phụ thuộc vào

(E.C. 3.2.1.91)

peroxidase (E.C.

khác

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hemicellulose. Chính nhờ sự liên kết chặt chẽ giữa cellulose, hemicellulose và
lignin đã làm cho cellulose vững chắc và khó phân giải hơn (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose
Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:
- Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao nên bền vững với tác động bên
ngoài.
- Vùng vô định hình do cấu trúc không chặt chẽ nên kém bền vững hơn.
Vùng vô định của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong
khi đó các mạng lưới liên kết hydro ở vùng kết tinh lại ngăn cản sự trương
này, nên enzyme chỉ tác động lên bề mặt các sợi.
Mặc dù với những phương pháp hiện có chưa đủ để xác định chính xác
cấu tạo của cellulose nhưng có thể thấy có rất nhiều kiểu gián đoạn và kết
thúc chuỗi, các bề mặt dị dạng và các vùng xoắn hoặc phân nhánh dọc theo
các vi sợi. Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose rõ ràng là không có sự
khống chế chặt chẽ nào để cho mọi sợi đều có chiều dài như nhau. Các sợi

Lê Thị Minh Phƣơng

5

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2



60

Vỏ đậu tương

51

Bông

91

Mía

34

Gỗ thông

41

Cây trưởng thành

42

Giấy báo

40÷80

Bã sắn

Rơm

Khóa luận tốt nghiệp

- Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã
sắn…
- Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
- Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Hệ thống cellulase
Để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự hiệp trợ của
các enzyme trong phức hệ cellulase. Phức hệ cellulase bao gồm 3 loại enzyme
chủ yếu:
- Endoglucanase (EC.3.2.1.4

β-Dglucan

glucanolhydrolase

hay

Carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase): có khả năng cắt đứt cellulose
các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi
nhưng đường khử tăng chậm do chúng thủy phân liên kết β-1,4glucozid một
cách tùy tiện trong mạch cellulose và giải phóng cellulodextrin, cellobiose.
Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng cellulose
vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh. Enzyme này được cho
là enzyme C x. Chính nhờ sự cắt trước của endoglucanase đã tạo ra các đầu
không khử, tạo điều kiện dễ dàng cho cellobiohydrolase do đó mà thủy phân
hoàn toàn được cellulose kết tinh.
- Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 β- glucan – celobiohydrolase viết tắt
là CBH). Enzyme này xúc tác tách liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử
(CBHI) và đầu không khử (CBHII) của chuỗi cellulose. Ngày nay nó được coi

Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm
1952 như sau:
Cellulose
tự nhiên

C1

Cellulose
hoạt động

Đường
hòa tan

Cx

Cellobise
Glucose

Theo tác giả này thì enzyme C 1 (tương ứng với exoglucanase) là “tiền
nhân tố thủy phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tự
nhiên thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, sau đó enzyme C x
(tương ứng với endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hòa
tan cellodextrin và cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose
dưới tác dụng của cellobiase.
Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điểm khác, thể hiện trên một sơ
đồ phức tạp hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose (Hình 1.3).

Lê Thị Minh Phƣơng

8



Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

các cellobiose ra khỏi chuỗi polyme. Khả năng làm giảm mức polyme hóa của
exoglucanase chậm song hàm lượng đường khử lại tạo ra nhiều. Trong khi đó
endoglucanase phân cách mạch polyme tùy tiện, không theo trật tự nào, tạo ra
các chuỗi oligosaccarit ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polyme hóa của
cellulose. Trong quá trình cắt gẫy mạch polyme, endoglucanase tạo ra các đầu
khử và không khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cắt thành cellobiose. Bởi
vậy, khi có tổ hợp endo- exoglucanase quá trình phân giải cellulose mạnh lên
nhiều.
Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá
trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme. Hiệu ứng này
đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng. Các kết quả quan trọng
thu được như sau:
1. Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình
phản ứng và sự giảm đáng kế của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi
cấu trúc của cơ chất cellulose.
2. Độ kết tinh của cellulose toàn phần vô định hình ví dụ: cellulose đã
xử lí axit photphoric thay đổi không đáng kể và vận tốc cao được duy trì trong
quá trình thủy phân.
3. Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng
kể trong quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi
không đáng kể.
4. Trị số độ polyme hóa của cellulose có độ kết tinh cao gần như không
thay đổi, còn của cellulose tái sinh vô định hình thì thay đổi rõ rệt.
5. Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp phụ của cellulase, sự kìm hãm

trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase
cho 2 mục đích chính:
- Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghiệp thực
phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường.
- Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối
cùng khác nhau.
Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:
- Công nghiệp chế biến thực phẩm:
+ Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.
+ Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau quả.
+ Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.

Lê Thị Minh Phƣơng

11

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Chế biến thạch từ rau câu.
+ Sản xuất rượu và một số axit hữu cơ.
- Công nghiệp dược phẩm:
+ Chế biến các chất tự tiêu hóa, loại bỏ các sợi không mong muốn.
- Sản xuất thức ăn gia súc:
+ Cải thiện độ tiêu hóa rơm, cỏ làm thức ăn gia súc.
+ Sản xuất thức ăn giàu protein.


trúc của vải mạnh như đá mài, hơn nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50%
do đã loại bỏ 50% thể tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài.
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực
trên các giấy phế thải thay thế dùng Cl hoặc ClO2 gây ô nhiễm môi trường.
Để làm sạch, trắng giấy người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase,
xylanase từ Sporotricchum pulverulentum, S. dimorphosphorum, cellulase từ
A. niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporium, hoặc mannase từ T. reesei.
Cellulase thường được dùng ở (0,001÷0,1%), cellulase (0,05÷0,5%),
cellobiase (0,005÷0,015%).
Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa. Tác dụng của cellulase
trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải trở nên mịn
đẹp, mềm sáng màu hơn. Cellulase thường được sử dụng kết hợp với lipase
(loại bỏ mỡ) và protease (loại bỏ protein). Các enzyme này dùng cho chất giặt
đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm.
Cellulase còn được sử dụng có hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật
trong kỹ nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài
hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông
nghiệp.
*Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức
cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme
bổ sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các
enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của
thức ăn, giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme

Lê Thị Minh Phƣơng

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi như: GS. Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…
kết quả thấy có nhiều triển vọng [4]. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc...[1]. Gần đây, đã có nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng
của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease,

Lê Thị Minh Phƣơng

14

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

xylanase, cellulase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn
của lợn con cai sữa. Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ
sung chế phẩm phytase và tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối
chứng tương ứng là: 13,3% và 32%. Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm
này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50% .
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay
ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên
nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết.
1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
Sinh tổng hợp cellulase là quá trình phức tạp chịu sự điều khiển của bộ

Sorbose một loại đường không khử và không phải là sản phẩm của quá
trình thủy phân cellulose cũng có vai trò điều hòa sinh tổng hợp và giải phóng
cellulase.
Lactose là chất cảm ứng hòa tan cho phức hệ enzyme cellulase của
Trichoderma lignorum. Tween-80 (0,1%) có ảnh hưởng tốt đến sinh tổng hợp
cellulase của Aspergillus terreus.
Nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Krebs (axit citric, succinic …)
là những chất ức chế của quá trình sinh tổng hợp cellulase. Alcol phenethylic
(PEA) là chất kìm hãm sinh trưởng và kích thích sinh tổng hợp cellulase của
Myrothecium verucaria. Một số hợp chất hóa học khác có cấu trúc tương tự
PEA như alcol benzylic, propylic, aceton cũng có tác dụng thúc đẩy sinh tổng
hợp cellulase. PEA tác động đến tế bào chất và thành tế bào, nơi xảy ra quá
trình sinh tổng hợp cellulase.
Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các
chi:

alternaria,

Aspergillus,

Chaetomium,

Coprinus,

Myrothecium.

Penicillium, Rhizopus, Trichoderma…
1.5.2. Vi khuẩn
Bacilus subtilis tổng hợp CMC-ase tốt nhất trên môi trường có chứa
chất cảm ứng là D (+) raffinose 0,2%. Các chất kìm hãm là glucose và


Clostridium, Pseudomonas...
Ngoài ra, xạ khuẩn cũng là đối tượng phân giải cellulose mạnh như:
Steptomyces,

Thermoactinomyces,

Micromonospora,

Steptosporagium,

Nocacdia.
* Thông thường trong phòng thí nghiệm để thử hoạt tính enzyme ban
đầu của vi sinh vật: C x (Endoglucanase) – dùng CMC (cellulose hòa tan,
Cacboxyl Methyl Cellulosse), C 1(exoglucanase) – dùng Avicel (cellulose kết
tinh), giấy lọc, có khi sử dụng bông (cellulose tự nhiên), β-glucosidase – dùng
cellobiose (cellulose mạch ngắn). Ở vi sinh vật sự hình thành đồng thời C1 và
Cx với tỉ lệ khác nhau tùy theo loài vi sinh vật, ví dụ Trichoderma reesei có
hoạt tính C1 rất mạnh trong khi tạo Cx ít hơn so với một số loại nấm khác.
1.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.6.1. Giống vi sinh vật
Như chúng ta đã biết, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành
enzyme và hoạt tính của nó trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Đặc tính sinh

Lê Thị Minh Phƣơng

17

K32D Sinh - KTNN