Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CBH
Cellobiohydrolase
CMC
Cacboxylmethylcellulose
HEC
Hydroxylethylcellulose
Bùi Thị Thủy
1
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
enzyme được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y tế,
nghiên cứu khoa học và bảo vệ môi trường.
Enzyme cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose
bằng cách thủy phân liên kết 1,4 – β – glucoside trong cellulose. Cellulose
được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật, trong đó nấm mốc có hoạt tính phân
giải mạnh hơn vi khuẩn như mốc Asperillus, Mucor…Cellulase là phức hệ
Enzyme quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Hầu hết
sử dụng cellulase vào hai mục đích chính: một là dùng cellulase trực tiếp
trong phân giải phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ
sung thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường; hai là thủy phân
cellulose tạo cơ chất lên men để thu sản phẩm cuối cùng khác nhau.
Đặc biệt trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng
suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở
mức cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm
enzyme bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi không những làm tăng khả
năng phân giải và hấp thụ thức ăn của vật nuôi dẫn đến tăng trưởng nhanh mà
còn đảm bảo chất lượng thịt. Mặt khác dưới tác động của enzyme bổ sung,
lượng thức ăn được phân giải và hấp thụ triệt để hơn nên giảm được lượng
phân thải ra do đó giảm bớt sự ô nhiễm môi trường [12].
Từ lâu, con người đã biết đến các chủng nấm mốc và ứng dụng của
chúng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp
dược phẩm, công nghiệp môi trường, nông nghiệp. Tuy nhiên cũng chưa có
Bùi Thị Thủy
3
Trường ĐHSP Hà Nội 2
sinh cellulase của một số chủng nấm mốc.
Bùi Thị Thủy
4
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
4.Ý nghĩa khoa học của đề tài
Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm
sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose.
Ý nghĩa thực tiễn: các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng ứng dụng
trong việc xử lí phế phẩm nông nghiệp làm thúc ăn gia súc.
5. Điểm mới của đề tài
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả sinh cellulase mạnh
từ phế phụ phẩm nông nghiệp.
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của
chủng M4V, M151 và M251 từ lên men rắn thu cellulase ứng dụng cho
chăn nuôi.
Bùi Thị Thủy
5
Bùi Thị Thủy
6
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho
sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm
nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzyme thủy phân cellulose [20].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho
sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 250C. Trong khi, quá trình phân hủy
sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [21].
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của cellulose
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn.Sinh khối thực
vật cả Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng
cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng rất nhỏ. Dưới đây là bảng
thông kê cho thấy hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu [25].
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu
Nguyên liệu
Cellulose
Nguyên liệu
Cellulose
56,6
Rơm
44
Kiều mạch
Bã sắn
Bùi Thị Thủy
7
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Trong các phế liệu, cellulose thường có mặt ở các dạng sau:
Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, cây ngô, cỏ …
Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, …
Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Các chủng sinh vật phân giải cellulose
Sinh tổng hợp cellulose là quá trình phức tạp chịu sự điều khiển của bộ
máy di truyền, sự hoạt hóa của các chất cảm ứng, và sự kiểm soát của các chất
trao đổi và các sản phẩm cuối cùng.
1.2.1. Nấm mốc
công nghiệp.Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ßglucanase nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống
Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng
với số lượng thấp exo-ß- glucanase [19].
Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn
cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát
triển của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ
thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và
không khí và môi trường xung quanh [22].
Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh
thểnhư là nguồn carbon duy nhất.Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào,
trongđó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel
polyacrylamide. Hoạt tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là
loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt và acid [16].
1.2.2. Vi khuẩn
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy
ở hai bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc
điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm
sinh lí sau [20]:
Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và
Caldicellulosiruptor)
Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)
Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)
Bùi Thị Thủy
9
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của
exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối cùng
β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành
glucose.
Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá
trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme.Hiệu ứng này
đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng. Các kết quả quan trọng
thu được như sau:
Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình phản ứng và
sự giảm đáng kể của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi cấu trúc của
cơ chất cellulose.
Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng kể trong
quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi không
đáng kể.
Trị số độ polyme hóa của cellulose có độ kết tinh cao gần như không thay đổi
còn của cellulose tái sinh vô định hình thì thay đổi rõ rệt.
Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp phụ của cellulose, sự kìm hãm của sản
phẩm và sự vô hoạt của cellulose, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vận
tốc thủy phân cellulose [9].
1.4. Hệ thống cellulose
Phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và
từnấm đã cho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzyme này. Hệ thống
cellulase được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc
của chúng.
cellulose.Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu
quả thủy phân cellulose cũng như hemicellulose và lignin trong tự nhiên.
1.5. Ứng dụng của cellulose
* Công nghiệp thực phẩm
Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.
Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.Trong quá trình sản
xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích ly dịch
quả từ thịt nghiền,ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase,
hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của
nước quả có thịt sẽ tốt hơn.
Bùi Thị Thủy
12
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà
rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại
tảo biển…[27].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase
trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện
tốt cho tác động của protease và đường hóa. Các chế phẩm enzyme amylase,
protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các
diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần
thiết để ủ bia [15].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, khi sử dụng chế phẩm
endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng
khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước
khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết.Endoglucanase và hemicellulase đã
được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [15].
*Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [15].
*Trong công nghệ xử lý rác thái và sản xuất phân bón vi sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả.
Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do
các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Đặng
Minh Hằng (1999) phân lập được 2 chủng nấm có khả năng phân giải
cellulose mạnh và đã tối ưu hóa được điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó
nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase, 192 chủng xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose đã được phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm
mục, gỗ mục trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh
chiếm 42% [8].
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà
máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc
Bùi Thị Thủy
14
kết quả tốt. Kết quả tăng trọng cuả trâu bò có thể đạt tới 12 – 17%, có khi còn
Bùi Thị Thủy
15
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
cao hơn [14], [15].Trên thế giới người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa
các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hàng năm người ta
sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme,
chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi như: GS.Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho lợn, gà, bò…,
kết quả thấy có nhiều triển vọng [3]. Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc…[1].Gần đây, đã có nghiên cứu về sự ảnh hưởng của enzyme
thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease, cellulase,
xylanase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn
con cai sữa. Kết quả cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase
hoặc tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 13,3% và 32%.
Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối
chứng là 50%
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng hiệu quả tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện
nay ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao
Trichoderma lignorum và Tr. koningi nuôi trên môi trường có nguồn
carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme là cao nhất.Kết quả cũng tương tự
như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi
ngô, bã củ cải. Đối với Stachybotrit atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng
hợp cellulase là tinh bột (1%) [11].
* Ảnh hƣởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng như các enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi
sinh vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc lựa chọn nguồn nitơ là rất cần
để đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế.
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông
(Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối
amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá
Bùi Thị Thủy
17
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
trình tổng hợp, vì trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit
hóa. Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm
mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.Natri nitrat làm cho môi trường kiềm
hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase.
Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase.Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống. Cao
Việc tạo thành α-amylase ở mốc A.oryzae không kìm hãm ở nhiệt độ
400C – 450C trong khoảng thời gian 10 – 12 giờ. Nhưng đối với nhiệt độ quá
300C sẽ làm giảm hoạt tính protease đi 2 lần hoặc hơn nữa [11].
* Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme.Thời
gian nuôi cấy quá dài hoặc quá ngắn đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme của
các chủng nấm mốc. Thời gian thích hợp để tổng hợp cellulase của
Aspergillus niger là từ 36h – 48h.
* Ảnh hƣởng của độ ẩm
Mỗi loài vi sinh vật cần một ngưỡng độ ẩm. Khi độ ẩm thấp chúng phát
triển chậm.Khi giảm Aw (hoạt tính của nước) dẫn đến sự thủy phân bào tương
và làm giảm hoạt tính của các enzyme. Ví dụ Staphylococcus aureus giảm tốc
độ sinh trưởng đến 10% khi Aw=0,9 [5].
Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp lên men rắn thì độ ẩm môi
trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nuôi
cấy. Nếu độ ẩm môi trường nuôi cấy quá thấp (< 50%) hoặc quá cao (> 80%),
nấm mốc không phát triển được hoặc phát triển rất chậm, do đó hàm lượng
enzyme sinh ra theo đó mà giảm dần.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bùi Thị Thủy
19
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
FeSO4
Thạch Agar
H2O
KH2PO4
pH
20
1 – 2 hạt
20g/l
1 lít
2g/l
5–6
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Môi trường nuôi cấy: Môi trường Czapek - Dox cơ sở thay sacaroza bằng lõi
ngô (vỏ trấu, vỏ lạc…).
KH2PO4
NaNO3
MgSO4.7H2O
KCl
NaCl
2g/l
Thạch Agar
H2O
pH
1 – 2 hạt
20g/l
1 lít
5–6
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1.Thu thập mẫu
Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rác thải ở những nơi
khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác
nhau.
2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản
Đầu tiên ta phải làm là khử trùng thiết bị và dụng cụ thí nghiệm bằng
tia UV. Tiến hành cân đo môi trường, cụ thể là môi trường Crapek - Dox cơ sở
để làm môi trường phân lập, môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C trong
45 phút sau đó phân phối khoảng 25ml môi trường vào hộp lồng đã vô trùng.
Để có môi trường thạch nghiêng giữ giống thì ta rót khoảng 3-4 ml môi
Bùi Thị Thủy
21
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Trường ĐHSP Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
2.3.2.3. Xác định hoạt tính enzim bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch (William, 1983)
Sử dụng khoan nút chai khoan 1 lỗ trên môi trường chứa CMC 1%.
Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 1ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch sau đó cho vào tủ ấm 300C
trong 24h. Nhỏ thuốc thử Liugon 1% sẽ xuất hiện vòng phân giải. Hoạt tính
enzyme được xác định bằng hiệu số (D – d) cm.
2.3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các
mức nhiệt độ khác nhau từ 250C đến 400C trong 36h. Hoạt tính cellulase của
các dịch được xác định theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các
mức thời gian khác nhau từ 12h đến 48h. Sau khoảng thời gian 12h, 24h, 36h,
48h, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn carbon lần lượt được sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi
cấy chủng trong thời gian 36h, sau đó lấy dịch, xác định hoạt tính cellulase
trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
* Xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek - Dox thích
hợp với nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4,
pepton trong thời gian là 36h. Sau đó lấy dịch enzyme, xác định hoạt tính
cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
của các chủng được trình bày ở bảng sau:
Đặc điểm của chủng
ST
Thời
Chủng
Màu của
mốc
khuẩn lạc
1
M1-51
Đen
2 ngày
1.7
Lá
2
M1-53
5
M1-7
Xanh rêu
2 ngày
0.6
6
M2 -1
Xám
3 ngày
1.2
Gỗ
7
M2-3
Xám đậm
3 ngày
Nâu
2 ngày
1.2
11
M3-4
Xanh Đen
1 ngày
0.5
12
M3-6
Trắng vàng
2 ngày
0.8
13
M3-7
Mẫu
Đất
mùn
T
Bùi Thị Thủy
gian xuất
hiện
25
Hoạt tính cellulase
D-d (cm)
Copyright: Tài liệu đại học ©