TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
ĐINH THỊ THU HƢƠNG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE CỦA CHỦNG NẤM MỐC
M151 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Phƣơng Phú Công
Hà Nội, 2012
1
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phƣơng Phú Công đã hƣớng dẫn,
chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện để em thực hiện và hoàn thành tốt
luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim
Nhung và các thầy cô trong tổ bộ môn Vi sinh vật học, cùng toàn thể thầy cô
trong khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều
kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè
trong suốt quá trình làm đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày…tháng 5 năm 2012
Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
4.
Ý nghĩa khoa học của đề tài ...................................................................... 3
5.
Điểm mới của đề tài .................................................................................. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1.
Cellulose.................................................................................................... 4
1.2.
Cơ chế phân giải cellulose ........................................................................ 6
1.3.
Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose ................................................. 8
1.3.1. Nấm sợi ..................................................................................................... 8
1.3.2. Vi khuẩn .................................................................................................... 8
1.3.3. Xạ khuẩn ................................................................................................... 9
1.4.
Hệ thống cellulase ..................................................................................... 9
2.2.2.2. Xác định hoạt tính bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm........................... 20
2.2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi
trƣờng thạch (William, 1983) ................................................................. 20
2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng đến hoạt tính Cellulase . 21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22
3.1.
Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose........... 22
3.2.
Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase
của chủng M151........................................................................................ 24
3.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên ............................................... 24
3.2.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả
năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 ....................................... 26
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase............................. 28
3.2.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy .......................................................... 29
3.2.5. Ảnh hƣởng của độ ẩm ............................................................................. 30
3.2.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ........................ 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 36
5
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lƣợng cellulose trong một số nguyên liệu
M151
Hình 3.11. Khả năng sinh cellulase của chủng M151 trên các nguồn nitơ
7
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
CBH
Cellobiohydrolase
CMC
Cacboxyl methyl cellulose
HEC
Hydroxyethyl cellulose
CMCase
Cacboxyl methyl cellulase
Cs
Cộng sự
C1
enzyme có sẵn trong đƣờng tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dƣỡng của
thức ăn giúp cho vật nuôi tiêu hóa đƣợc tốt hơn [14].
Từ lâu, con ngƣời cũng đã biết đến các chủng nấm mốc và ứng dụng
của chúng trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm, công
nghiệp dƣợc phẩm, công nghệ môi trƣờng, nông nghiệp. Tuy nhiên cũng chƣa
có nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc phân giải cellulose,
9
nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật ƣu thế hơn so
với nấm mốc về khả năng sinh celllulase. Nhƣng nếu xét về khả năng sử dụng
nguồn cacbon, nguồn nitơ, khả năng chống chịu pH…thì nấm mốc tỏ ra ƣu
thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác [4]. Hàng năm, hoạt động trong
ngành nông nghiệp đã thải ra môi trƣờng hàng trăm tấn phế thải, hiện đã và
đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng. Nếu lƣợng
phế phẩm này đƣợc xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì đó là một
nguồn lợi lớn. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về
cellulase ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi nhƣ: Chu Thị Thanh Bình và cs
(2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu
cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên
men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger
sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…và kết quả cho nhiều triển
vọng [5].
Đề tài của tôi tập trung vào nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh
hƣởng đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151, ứng dụng
trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc.
đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên
vách tế bào thực vật. Tổng lƣợng của chúng chiếm tới 50% tổng số
hydratcacbon trên trái đất.
Về cấu trúc hóa học, cellulose là một polymer mạch thẳng do các Dgluco-pyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glucozid. Các đơn phân
glucose trong cellulose có cấu hình dạng ghế, quay 1 góc 1800 so với phân tử
trƣớc nó. Các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [23].
Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của cellulose
Về cấu trúc không gian, cellulose có cấu trúc dạng sợi song song dài
khoảng 5µm với đƣờng kính 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên
kết hydro và liên kết Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đƣờng kính 10-
12
40 nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên
cấu trúc mixen của cellulose, cellulose dạng mixen gồm có 2 vùng.
Vùng kết tinh (crystalline): có cấu trúc trật tự cao gồm các sợi chặt chẽ,
ngăn cản sự hấp thụ nƣớc ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu
trúc cellulose.
Vùng vô định hình (amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ nên
kém bền vững, do vùng có thể hấp thụ nƣớc và trƣơng lên.
Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose
Cellulose tự nhiên không tan trong nƣớc, axit, hay kiềm loãng và nhiều
dung môi hữu cơ khác. Chỉ có axit hay kiềm nóng mới có tác dụng phân giải
cellulose. Trong tự nhiên có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
thủy phân đƣợc cellulose nhƣ: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc…
Cellulose đƣợc tổng hợp hàng năm với khối lƣợng lớn. Sinh khối thực
vật cả Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lƣợng
36
28
60
91
44
Trong các phế liệu cellulose thƣờng có mặt ở các dạng sau:
Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, cây ngô, cỏ …
Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn…
Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cƣa, gỗ vụn…
Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Cơ chế phân giải cellulose
* Reese và các cộng sự lần đầu tiên đƣa ra cơ chế phân giải vào năm 1952
nhƣ sau:
Cellulose tự
nhiên
C1
Cellulose hoạt
động
Cx
Đƣờng hòa
tan
Cellobiase
Glucose
Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973
Đầu tiên endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt
cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do.
Tiếp đó, dƣới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính
khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của
exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối
cùng β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose
thành glucose.
15
1.3. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
1.3.1. Nấm sợi
Theo Carle-Urioste và cs cơ chế cảm ứng của cellulose đến sinh tổng
hợp cellulase ở nấm sợi T.reesei dựa trên sự có mặt một lƣợng nhỏ cellulase
sẵn có trong nấm.
Các kết quả của Hrmova và cs cho thấy rằng các disaccarit trong tự
nhiên cấu tạo bởi glucose và xylose, có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh
tổng hợp cellulase của nấm sợi Aspergillus niger. Chất cảm ứng tốt nhất là 2O-beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và 2-Obeta-D- glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) hoặc các đồng phân của
chúng cũng là những chất cảm ứng tốt. Loewenberg và cs khi nghiên cứu
cellulase của nấm sợi Trichoderma cũng có kết luận rằng: chỉ một lƣợng nhỏ
sophorose cũng gây lên sự tổng hợp cellulase. Bổ sung nhiều lần với một
lƣợng nhỏ sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lƣợng lớn.
Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thƣờng thuộc các
chi:
Aspergillus,
Alternaria,
Nocacdia,
Streptosporagium,…
1.4. Hệ thống cellulase
Hệ thống enzyme thủy phân cellulose gồm có 3 loại enzym chủ yếu:
endoglucanase(1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,EC.3.2.1.4), exoglucanase
(1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91), β-glucosidase (EC.3.2.1.21)
Endoglucanase
EC.3.2.1.4:
hay
là
1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-
glucannohydrolase hoặc Carboxymethylcellulase (viết tắt là CMCase). Đôi
khi ngƣời ta có thể gọi enzyme này bằng tên khác là endo-1,4-β-D-glucanase;
β-1,4-glucanase; cellulase A,…Enzyme này thƣờng thủy phân các liên kết
1,4-β-D-glucosid trong mạch cellulose một cách tùy tiện và giải phóng
cellulodextrin, cellobiose, ngoài ra còn cắt đứt các liên kết β-D-glucan của các
loại ngũ cốc. CMCase phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng
cellulose vô định hình nhƣng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh.
Exoglucanase EC.3.2.1.91: hay là 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase,
(viết tắt là CBH) các tên khác nhƣ exo-cellobiohydrolase, exoglucanase,
cellulase Cl, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase. Enzyme này xúc tác tách
liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose. Ngày nay nó đƣợc coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi
nó có khả năng phân cắt cellulose ở cả vùng kết tinh. Hoạt tính enzyme này
cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế
phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất
bóc vỏ khá cao. Trong quá trình trích ly dịch quả, cellulose và pectin cản trở
sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm
Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [12].
18
Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng
chất lƣợng agar-agar hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vở thành tế
bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực
vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những
ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.
Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu đƣợc chế phẩm có cellulase
hoạt độ cao.
*Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Ở công
đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình
của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng
cho quá trình nghiền cơ học. Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với
endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng
khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc
khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã
đƣợc dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [16].
*Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, ngƣời ta không bổ sung riêng rẽ chế phẩm
enzyme này mà thƣờng bổ sung cùng với các enzyme khác nhƣ: amylase,
protease, xylanase...tạo ra một dạng chế phẩm enzyme hỗn hợp (multienzym).
Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải đƣợc nhiều loại cơ
chất, vật nuôi sẽ hấp thụ các nguồn thức ăn tốt hơn.
20
Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, ngƣời ta thấy lợn con theo ổ tăng
trọng 20% và giảm thức ăn 6 – 14%. Thí nghiệm trên lợn 1 – 3 tuần tuổi thì
lợn tăng trọng 8 – 40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10 – 18% [3].
Ngƣời ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá
trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò đƣợc gắn liền với hoạt động
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đây. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu đƣợc
kết quả tốt. Kết quả tăng trọng cuả trâu bò có thể đạt tới 12 – 17%, có khi còn
cao hơn [15], [16]. Trên thế giới ngƣời ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa
các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hàng năm ngƣời ta
sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme,
chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc đƣợc sản xuất.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi nhƣ: GS.Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho lợn, gà, bò…,
kết quả thấy có nhiều triển vọng [5]. Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc…[1]. Gần đây, đã có nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của enzyme
Đối với nấm sợi A.fumigatus và các loại nấm mốc ƣa nhiệt, nguồn
cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trƣờng cám và bã
củ cải đƣờng là môi trƣờng thích hợp nhất đối với T.reesei [10].
Trichoderma lignorum và Tr.koningi nuôi trên môi trƣờng có nguồn
cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme là cao nhất. Kết quả cũng tƣơng tự
nhƣ vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trƣờng có giấy lọc và lõi
ngô, bã củ cải. Đối với Stachybotrit atra nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng
hợp cellulase là tinh bột (1%) [13].
22
* Ảnh hƣởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng nhƣ các enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi
sinh vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc lựa chọn nguồn nitơ là rất cần
để đảm bảo đƣợc hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế.
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông(Hyphomycetales)
nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối amon ít có tác
dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp,
vì trong môi trƣờng các muối này làm cho môi trƣờng axit hóa. Điều này
không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm mất hoạt tính
enzyme sau khi tạo thành. Natri nitrat làm cho môi trƣờng kiềm hóa, tạo điều
kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase.
Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase. Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống. Cao
ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật,
nhƣng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao
hơn so với nấm men.
Mỗi loài vi sinh vật cần một ngƣỡng độ ẩm. Khi độ ẩm thấp chúng phát
triển chậm. Khi giảm Aw (hoạt tính của nƣớc) dẫn đến sự thủy phân bào
tƣơng và làm giảm hoạt tính của các enzyme. Ví dụ Staphylococcus aureus
giảm tốc độ sinh trƣởng đến 10% khi Aw=0,9 [6].
Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phƣơng pháp lên men rắn thì độ ẩm môi
trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nuôi
cấy. Nếu độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy quá thấp (< 50%) hoặc quá cao (> 80%),
nấm mốc không phát triển đƣợc hoặc phát triển rất chậm, do đó hàm lƣợng
enzyme sinh ra theo đó mà giảm xuống.
24
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật
Sử dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose đƣợc phân lập từ
lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục đƣợc lấy ở một số nơi nhƣ:
huyện Tam Dƣơng (Vĩnh Phúc), huyện Mỹ Đức, huyện Mê Linh (Hà Nội).
2.1.1. Nguyên liệu
Lõi ngô, vỏ trấu, vỏ lạc đƣợc sấy khô và nghiền nhỏ.
Cacboxylmethyl cellulose (CMC).
2.1.2. Môi trƣờng
2.1.2.1. Môi trường bảo quản và giữ giống
Nồng độ
Hóa chất
Đƣờng saccarose
30 g/l
25
Copyright: Tài liệu đại học ©