LỜI CAM ĐOAN
Xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Lê Thị Nhanh với sự hướng
dẫn của Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Một số
yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng họp protease từ Aspergillus niger bằng
phương pháp lên men rắn” đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Người viết
Trần Thanh Trúc
Người hướng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Lê Thị
LỜI CẢM ƠN
Em cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi được thực hiện luận văn tốt nghiệp dưới
sự hướng dẫn của Trần Thanh Trúc.
Lời cảm ơn đầu tiên, em xin được gởi đến Cô Trần Thanh Trúc đã giành nhiều thời
gian và công sức để tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn
thành luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mười, Thầy luôn đóng góp
cho em rất nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian hướng dẫn, cùng em tìm
hướng giải quyết cho những vấn đề mới phát sinh để có kết quả thu nhận tốt nhất.
Trong suốt quá trình làm luận văn, em cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình cũng như sự ủng hộ, động viên to lớn của Chị Lê Thị Bảo Ngọc và các anh chị
trong phòng thí nghiệm D006, các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K36.
Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm
- khoa Nông Nghiệp và Sinh Học ứng Dụng, trường Đại học cần Thơ, đã tận tình giảng
dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trinh
học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin được gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến
khích, ủng hộ đã dành cho em trong suốt chặng đường để hoàn thành được luận văn
này.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -3-
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sình học ứng dụng - V-
DANH SÁCH HÌNH
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -5-
DANH SÁCH BẢNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
A. niger Aspergillus niger
CFU Colony Forming Unit (mật số bào tử hình thành)
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
EGTA Ethylene Glycol Tetra Acetic acid
KCN Khu Công Nghiệp
PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
rpm revolutions per minute
SSF Solid State Fermentation
TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn
TTHĐ Trung Tâm Hoạt Động
u
Đơn vị hoạt tính enzyme
u/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 g cơ chất)
U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 mL cơ chất)
v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lượng)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -7-
CHƯƠNG 1 MỞ ĐÀU
1.1 TỔNG QUAN VÈ ĐỀ TÀI

giá trị thu hồi protease cao nhất (Qazi et al., 2008).
Các ngành công nghiệp nói chung và công nghiệp thực phẩm nói riêng đang trên đà
phát triển. Điều này hứa hẹn cho một nhu cầu to lớn về protease. Mặt khác, các phụ
phế phẩm dồi dào của nước ta có thể sử dụng như nguồn cơ chất cho quá trình sản
xuất protease ưa acid từ A. niger. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất
lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD -8-
Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang được nghiên cứu
trong nhiều năm qua. Tuy nhiên, những kết quả đạt được trong lĩnh vực này vẫn chưa
đáp ứng được việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này
trong đời sống.
Việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hoạt tính protease được thu nhận từ vi sinh vật,
thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình tổng họp enzyme này là vấn đề
cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Chính vì vậy, nghiên cứu về khả năng sinh
tổng họp protease cần được tiến hành một cách cụ thể thông qua các bước khảo sát
các điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng họp protease từ dòng nấm mốc trên.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là tìm ra điều kiện lên men thích hợp cho
quá trình sinh tổng họp protease ưa acid trên môi trường rắn (SSF) với dòng A.niger
đặc hiệu.
Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài đưa ra các nội dung nghiên cứu sau:
1) Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến quá trình lên men rắn sinh tổng họp protease.
2) Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng thu nhận protease có
hoạt tính cao từ Aspergillus niger.
3) Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình sinh tổng họp protease.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình tổng họp
protease ở các nhiệt độ khác nhau.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD -9-

protease aspartic, protease cystein và metalloprotease.
• Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm hoạt
động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serin
protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
• Protease aspartic: Hầu hết các protease aspartic thuộc nhóm pepsin (các enzyme tiêu
hóa: pepsin, chymosin, cathepsin, renin) có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
• Protease cystein: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động, thường hoạt động ở pH
trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
• Metallo proteinase: thường tím thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc
cao hon. Metallo proteinase hoạt động ở pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác
dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease còn được phân loại theo khoảng pH hoạt động, và được chia thành:
+ Protease acid: pH 2 - 4 +
Protease trung tính: pH 7 - 8 +
Protease kiềm: pH 9 - 11 (Ahmed
et al., 2011).
2.1.2 Tính chất của protease ưa acid
Protease ưa acid (EC 3.4.23) còn được gọi là aspartic acid protease. Đây là một
endopeptidase với khối lượng phân tò dao động trong khoảng từ 30 - 45kDa. Enzyme
này có khả năng hòa tan trong nước và hoạt động tối ưu ở độ pH thấp (Vishwanatha et
al., 2009). Điểm đẳng điện của protease ưa acid nằm trong khoảng pH 3,0 - 4,5. Trung
tâm hoạt động của enzyme này có chứa chuỗi trình tự các acid amin Asp-Xaa-Gly, trong
đó Xaa có thể là Ser hoặc Thr. Các protease ưa acid bị ức chế bởi pepstatin (Fitzgerald
et al., 1990).
Ngoài ra, các hợp chất diazoketone như diazoacetyl-dl-norleucine methyl ester (DAN)
và l,2-epoxy-3 (p-nitrophenoxy) propan (EPNP) ừong sự hiện diện của các ion đồng
cũng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme này (Rao et al., 1998).
Protease ưa acid thường được tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al, 2004). Một số protease

Giống như các enzyme khác, các nghiên cứu đối với protease cũng khẳng định, biến đổi
động học của enzyme này chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ enzyme, nồng độ
cơ chất, pH, nhiệt độ cũng như tác động của các chất hoạt hóa và kìm hãm (Ly Nguyên,
2004; Duvetter, 2007; Arotupin et al., 2008).
2J.5J Anh hưởng của nồng độ cơ chất
Các nghiên cứu đối với protease cho thấy, phản ứng của protease thuộc trường hợp đơn
giản nhất - chỉ có một cơ chất, theo phương trình 1.1:
E+SỊ
k
' >ES »E+P
*- (1.1)
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm; ki, kLi là hằng số tốc độ phản ứng tạo
thành phức chất £S và phân ly phức chất ES thành E và s, k
2
là hằng sé tốc độ phản ứng
tạo thành E và p (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Với sự biến đổi động học phản ứng theo phương trình một cơ chất, hằng số Micheaỉỉs -
Menten cũng được ứng dụng để thể hiện tốc độ củâ phản ứng và đặc trưng cho protease.
Ở giai đoạn đầu phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và nồng độ cơ chất
thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng
độ cơ chất tiếp tục tăng, đường biễu diễn uốn cong và với nồng độ cơ chất cao thì vận
tốc không còn gia tăng nữa và đường biễu diễn tiệm cận với giá trị Vmax-
Hình 2.4: Phuưng trinh Michealis - Menten
K
m
là hằng số Michealis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc Vi vận tốc

Hằng số K
m
tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme cũng như phương pháp xác định hoạt tính.

kích hoạt protease khác nhau. Đối với protease được ly trích từ việc lên men chủng
Acinetobacter sp. NQ6, K
+
, Na
+
, Mg
2+
là những ion hoạt hóa mạnh, có khả năng làm
tăng hoạt tính protease, còn ion Ca
2+
có ảnh hưởng không đáng kể. Ion Zn
2+
chỉ ức chế
protease ở nồng độ cao 10-20 mM. Các ion kim loại khác Cu
2+
, Co
2+
, Pb
2+
và Hg
2+
ức
chế protease ngay ở nồng độ thấp 2 mM và ức chế hoàn toàn ở nồng độ cao đối với Pb
2+
và Hg
2+
Chất tạo gọng kìm EDTA kìm hãm protease hoàn toàn ở mọi nồng độ (Quyền
Đình Thi, 2007).
2.1.5.5Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độngprotease
Một yếu tố thường ảnh hưởng đến sự ổn định protein là sự phân giải bởi chính

Leupeptin Thiol protease 1 |j,g/mL
EDTA & EGTA Protease kim loại 0,1-lmM
Nguồn: Phan Thị Bích Trâm (2011)
2.1.6 Tầm quan trọng của việc sử dụng protease trong thực tiễn
Protease ưa acid còn có ứng dụng trong sản xuất vật liệu gia vị, thủy phân protein, giúp
làm tăng nồng độ của các acid amin trong quá trình lên men của nước tương (Rao etal.,
1998).
Bên cạnh đó, protease ưa acid cũng là một yếu tố rất hữu ích trong ngành công nghiệp
da và lông thú ( />2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Aspergillus nỉger
2.2.1 Giói thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên các
cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác
nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất
enzyme (điển hình như a - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong
công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid
citric, acid gluconic, .(Pansear et al., 2010).
Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên cứu khởi
đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ Cryptogamae, giới
Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dưới kính hiển vi tiếp theo đã
chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật (Sumbali, 2005). Samson và van
Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp: Phycomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes. Hệ thống phân loại này đã tồn tại
một thời gian dài và A. niger được phân loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ nấm bất
toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae, chi
Aspergillus và loài Aspergillus niger (Samson và van Reenen- Hoekstra, 1988).
Tuy nhiên, vói sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế
kỷ XX, bắt đàu tò nghiên cứu phân chia nhỏm của Whittaker (1969, trích dẫn bởi
Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali, 2005) đã
đề nghị khỏa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A. niger nói riêng thuộc:
Ngành: Amastigomycota

to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các
cuống thể bình màu nâu, dài 10 - 15 ịj.m, là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một
tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình
thành chuỗi hưáng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non
nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào tử đính hình cầu, thường dẹt,
đường kính 4-5 ịim, nhưng thường nhỏ hơn (Onions et al., 1981). Loài A. niger được
phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử dính màu đen.
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC ĐIÈU KIỆN LÊN MEN ĐÉN
QUÁ TRÌNH SINH TỒNG HỢP PROTEASE
2.3.1 Vai trò của co' chất trong quá trình sinh tồng hợp protease
Các loại nắm mốc ừong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống. Với mồi
nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh tổng hợp enzyme tương thích, đặc hiệu vởỉ cơ
chất đó nhằm chuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu thành dạng cơ chất đơn giản
dễ hấp thu (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nói cách khác, muốn thu nhận enzyme nào thì
phải có sự hiện diện của cơ chất đặc hiệu với enzyme đó trong môi trường nuôi cấy
(Rombouts và Pilnik, 1981). Tác động của cơ chất đặc hiệu đạt hiệu quả cao khi ở một
nồng độ nhất định. Nếu vượt quá nồng độ tối đa cho phép thì khả năng sinh tồng hợp sẽ
giảm (Rombơuts và Pilnik, 1981).
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết đỉnh khả năng sinh tổng hợp
protease cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có
đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng họp
enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010; bảng 1.2).
Bảng 2.2: Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
2.3.1.1 Ảnh hưởng của thành phần đa lượng
Trong các yếu tố ảnh hưởng của thành phần môi trường, nguồn carbon là thảnh phần
đầu tiên, đóng vai trò đặc biệt trong sự phát triển của vi sinh vật. Trong quá trình sinh
tổng hợp protease, nguồn carbon có độ methoxyl hóa cao và đơn phân tò như acid
pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác thường được sử dụng. Các
thành phần này không chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho sự phát triển của
vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp

Phospho Phosphate vô cơ
Xây dựng nên các acic
nucleic,
nucleotide, phospholipid, acid teichoic
Thức ăn vi lượng
SO4
2
H2S, SO2, hợp Xây dựng nên cystein, methionine,
Lưu huỳnh
chất hữu cơ chứa lưu
huỳnh
glutathione và nhiều coenzyme
Kali Muối kali Xây dựng nên các cation vô cơ của tê
bào và là đồng nhân tố của các enzyme
Dạng các cation vô cơ của tê bào và là
Magie Muối magie
đồng nhân tố cho nhiều phản ứng
enzyme
Calcium Muối Calcium Cation vô cơ là đông nhân tô cho nhiêu
enzyme và là cấu phần của nội bào tử
Câu phân của cytochrome và các protein
Săt Muôi săt
khác cũng là đông nhân tô cho một sô
phản ứng enzyme
Nguồn: Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành (2010)
protease. Nguồn nitrogen cũng có vai trò như chất cảm ứng, ảnh hưởng không nhỏ đến
quá trình sinh tổng họp protease. Nitrogen tham gia vào quá trình tạo protein, acid
nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Tuy nhiên, khi nồng
độ nitrogen tăng cao sẽ là chất kìm hãm cho sự sinh tổng hợp enzyme. Tỷ lệ giữa carbon
và nitrogen trong môi trường, hay tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon

gian, độ ẩm hay pH ban đầu của môi trường ủ là những yếu tố có sự chi phối rất lớn đến
quá trình phát triển và hình thành enzyme .
2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy và khả năng sinh enzyme
của vi sinh vật. ở nhiệt độ thấp, sản lượng protease thu được không cao (Damare et al.,
2006). Tuy nhiên ở nhiệt độ cao, quá trình trao đổi chất và phát triển của vi sinh vật bị
hạn chế (Haq et al., 2006). Đồng thời, enzyme protease bị biến tính và mất hoạt tính xúc
tác do sự kéo dài và phá vỡ của các liên kết hydro trong cấu trúc của enzyme (Conn et
al., 1987). Nhiệt độ tối ưu của các loài Aspergilus khác nhau thì khác nhau và nằm trong
khoảng 30°C-40°C (Coral et al. 2002; Charles et al., 2008; Negi và Baneijee 2010).
2.3.3 Độ ẩm môi trường
Thành phần nước chiếm từ 70 -ỉ- 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả quá trình
phân hủy thức ăn và các phản ứng chuyển hóa các chất trong tế bào đều diễn ra với sự
có mặt của nước. Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, ngược lại độ ẩm thấp quá sẽ
kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme (Lê
Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010).
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối ưu của môi trường là 58 -ỉ- 60% và sự duy
trì độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi đóng vai trò quan trọng. Độ ẩm
tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hon 50% làm kìm hãm sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như giảm hiệu quả hình thành enzyme (Pandey
et al., 2000). Khi nuôi cấy trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi
trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60% để tránh sự nhiễm khuẩn, vi sinh
vật lạ (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.4 Điều kiện pH ban đầu của môi trường
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm
ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong suốt thời gian
nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường ủ có ảnh hưởng không nhỏ đến
sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Giá trị pH tối ưu của enzyme có
nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 5,5 (Trần Xuân Ngạch,
2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng enzyme, loại cơ chất và nguồn nấm

chỉ ra một số thuận lợi và bất lợi của SSF so với SmF.
2.3.6.1 Thuận ỉợi
- Môi trường nuôi cấy đơn giản;
- Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường rắn hoặc bổ sung thêm một
số chất dinh dưỡng;
- Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dàng tinh sạch;
- Sử dụng kết họp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc tế bào;
- Độ ẩm thấp và mật số nấm mốc lớn nên hạn chế được sự lây nhiễm của nhiều loại vi
sinh vật khác;
- Lượng tạp chất sinh ra thấp hơn trong SmF;
- Enzyme ít nhạy cảm với các chất ức chế dị hóa hoặc cảm ứng;
- Trong điều kiện thiết bị đơn giản, không có thiết bị phản ứng sinh học, việc lên men SSF
là phương thức hiệu quả, dễ thực hiện, có tính khả thi cao.
23.6.2 Bất lợi
- Các vi sinh yật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào cản về độ ẩm của môi
trường;
- Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxy tự do, CO2 là một vấn đề khó khăn do
thiếu thiết bị kiểm tra sản xuất (pectinases, amylase, protease ưa acid,
amyloglucosidases, ) ở quy mô công nghiệp (Lonsane và Ghildyal, 1992).
Ngoài ra, Mitchell và Lonsane (1992) cũng đã nêu ra ưu điểm của SSF là: phương pháp
đơn giản, chi phí sản xuất thấp hơn, sản lượng enzyme cao và nước thải đầu ra thấp. Do
vậy phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất protease. Trong quá trình
lên men SSF các phụ phẩm nông-công nghiệp thường được coi là các chất nền tốt nhất
(Pandey et al., 1999).
2.4MỘT SỐ NGHIÊN cứu CÓ LIÊN QUAN
Haq et al. (2004) đã khẳng định được bột đậu nành là sản phẩm nông nghiệp tốt nhất có
khả năng sử dụng như cơ chất chính cho việc sản xuất protease từ Pénicillium
griseoroseum. Ngoài ra, cám gạo và bột hướng dương cũng được sử dụng làm cơ chất
lên men cho dòng nấm Rhizopus oligosporous trong quá trình sản xuất protease (Ikasari
và Mitchell, 1994; Haq et al., 2003). Chakraborty et al. (2000) cũng đã nghiên cứu sản

0,758 HP/mL, lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/mL) 1,2 lần. Trong tất cả các
nguồn nitrogen bổ sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758
HP/mL) cao hơn mẫu đối chứng (0,511 HP/mL). Các thí nghiệm có bổ sung kết họp các
nguồn nitrogen và carbon vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với
khi khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của hàm
lượng tinh bột (0,25-^1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của dòng này, hoạt
độ quan sát đạt được giá trị cao nhất (0,760 HP/mL) ở hàm lượng tinh bột 0,75%. Đồng
thời, hoạt độ protease đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường thích họp với pH ban
đầu bằng 8 và nhiệt độ 35°c. Thời gian thu nhận enzyme thích hợp nhất khi nuôi cấy
dòng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt độ đạt được là 0,777 HP/mL.
Trước đó, Quyền Đình Thi et al. (2007) cũng đã nghiên cứu tối ưu một số điều kiện nuôi
cay Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng họp protease. Ket quả khảo sát cho thấy, hoạt tính
protease đạt tối đa khi dòng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 được nuôi cấy trong
môi trường LB ở pH 7,0 bổ sung 20% (v/w) nước biển ở nhiệt độ 30°c và thời gian ủ 48
giờ.
Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực tuyển chọn dòng vi sinh vật
phù hợp cho hoạt động của enzyme đặc hiệu (protease) đến việc tối ưu hóa quá trình
sinh tổng họp enzyme này, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:
- Hoạt tính của protease thu nhận phụ thuộc vào dòng vi sinh vật đặc hiệu - chịu sự chi
phối của điều kiện môi trường sinh trưởng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu protease chỉ
thường được thực hiện trên đối tượng vi khuẩn (Bacillus sp.), trong khi việc sử dụng
dòng nấm sợi, điển hình là A.niger trong nuôi cấy protease được áp dụng rất rộng rãi
trên thế giới. Các ngân hàng giống vi sinh vật ở Việt Nam cũng không có giống đặc hiệu
riêng cho protease.
- Các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, sinh tổng hợp protease phụ thuộc vào từng
dòng vi sinh vật khảo sát - cần phải được xác định cụ thể theo thực nghiệm.
Chính vì vậy, việc thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình tổng hợp enzyme
protease của dòng Aspergillus niger bản địa được thực hiện.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.1PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM