TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
***********

KHỔNG THỊ MAI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT BẢO VỆ
Ở HẠT ĐẬU CÔVE (Phaseolus vulgaris L.)
NẢY MẦM TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS MUỐI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính
trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô và tập thể cán bộ
trong Khoa Sinh - KTNN và Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và
Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện để em thực hiện đề tài này.
Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không
tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến
của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014

: Cộng sự

ĐC

: Đối chứng

HSP

: Heat shock protein

Nxb

: Nhà xuất bản

P5CS

: Pyrolin - 5 - cacboxylate - synthetase

STT

: Số thứ tự

TN

: Thí nghiệm


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Nồng độ prolin và OD
Bảng 2. Nồng độ glucoz và giá trị OD585nm

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 3
3. Ý nghĩa lí luận - thực tiễn ........................................................................... 3
NỘI DUNG ................................................................................................... 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu côve ....................... 4
1.1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật............................................................... 4
1.1.2. Sự nảy mầm ở hạt đậu côve .................................................................. 5
1.2. Tình hình nghiên cứu về một số chất bảo vệ đối với thực vật .................. 6
1.2.1 Trên thế giới .......................................................................................... 6
1.2.2. Ở Việt Nam .......................................................................................... 8
1.3. Prolin và vai trò của prolin .................................................................... 10
1.4. Glyxin betain và vai trò của glyxin betain ............................................. 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 15
2.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 15
2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ...................................... 16
2.3.1. Xác định hàm lượng prolin trong mô thực vật (theo Bates và CS) [12]16
2.3.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp vi phân tích (theo
Phạm Thị Trân Châu) [12] ........................................................................... 19
2.3.3. Định lượng glyxin betain (theo Gvieve và Grattan, 1983) [12] ........... 22
2.4. Phương pháp xử lí số liệu thống kê ........................................................ 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................ 24
3.1. Xác định nồng độ NaCl thích hợp cho nghiên cứu ................................. 24


3.2. Hàm lượng prolin ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện gây stress
muối NaCl .................................................................................................... 26
3.3. Hàm lượng đường khử ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress

nguyên nhân làm cho quá trình tao đổi chất diễn ra không bình thường, gây
hạn sinh lí, kìm hãm sự sinh trưởng và ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự
sinh trưởng và phát triển cây. Hiện tượng nhiễm mặn từ nguồn nước biển,
nguồn nước ngầm và do cách canh tác của con người đã gây khó khăn cho

1


việc gieo trồng các loại đậu đỗ nói chung và đậu côve nói riêng. Nhiễm mặn
là nguyên nhân làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra không bình thường,
ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Để tăng năng suất đậu côve một trong những biện pháp là làm tăng khả năng
chống chịu của chúng với ngoại cảnh bằng cải tiến kĩ thuật trồng trọt, chọn
tạo giống mới hoặc lựa chọn nhiều nơi trồng có điều kiện ngoại cảnh thích
hợp. Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu phản ứng cũng như ảnh hưởng của
muối NaCl tới quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu côve trong các điều
kiện môi trường có dung dịch muối NaCl với các nồng độ khác nhau để tìm
được giới hạn chịu mặn của đậu côve và điều kiện mà cây sinh trưởng tốt nhất
từ đó tăng năng suất đậu côve.
Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu hạn, chịu mặn,… của cây
trồng nói chung, đậu côve nói riêng ngày càng được mở rộng vì tính ứng dụng
cao của cây trồng họ Đậu. Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà khoa
học có điều kiện tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu hạn, chịu mặn của
thực vật như sự ảnh hưởng của điều kiện thiếu nước đến sự nảy mầm của hạt
và phát triển của cây non, đến quá trình quang hợp và hô hấp. Các cơ chế sinh
hóa và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu như xác định vị trí của gen
liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu, gen tổng hợp 1 số chất hình thành
và tích lũy khi hạn hán như prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường…. Tuy
vậy, để tìm hiểu rõ ảnh hưởng của muối NaCl và bản chất khả năng chịu mặn
của đậu côve cần có những nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu về

muối, giúp cho việc xác định nhanh khả năng chống chịu của giống đậu côve
trên đất có nồng độ muối cao.

3


NỘI DUNG
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu côve
1.1.1. Quá trình nảy mầm ở thực vật
Nảy mầm là giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá thể. Quá trình
nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với tốc độ cao để
chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới.
Quá trình nảy mầm của hạt bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn
đều có những đặc điểm sinh lí, sinh hóa đặc trưng. Gồm:
- Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nước rất mạnh làm cho
hạt trương lên.
- Pha hình thành và hoạt hóa enzyme: trong hạt có một lượng enzyme
nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết. Do vậy không có hoạt tính, khi hoạt
hóa bởi nước, enzyme được giải phóng ở dạng tự do bắt đầu hoạt động mạnh.
- Tích lũy dinh dưỡng: ngay những phút ngâm nước đầu tiên cường độ
hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt là chu trình hexozmonophotphat tăng lên
nhiều lần, do vậy lượng ATP tích lũy nhiều.
- Động viên các chất dinh dưỡng và xây dựng các chất hữu cơ đặc
trưng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dự trữ trong hạt chủ yếu
phụ thuộc 3 nhóm chất hữu cơ: gluxit, protein, lipit. Trong quá trình nảy mầm
enzyme  -amylaza tác động vào liên kết 1, 4 - gluxit của phân tử tinh bột
làm phân giải tinh bột thành các dextrin tham gia vào quá trình hô hấp và ở
dạng xaccarozo tích lũy ở các tế bào phụ phôi. Protein được phân giải bởi
enzyme proteza thành các axit amin và amit. Phần lớn các axit amin tạo thành

khoảng 5 - 10 ngày sau khi gieo. Thời kì này chính là thời kì quyết định mật
độ cây con cũng như sức sinh trưởng của cây đậu côve sau này.

5


1.2. Tình hình nghiên cứu về một số chất bảo vệ đối với thực vật
1.2.1 Trên thế giới
Thực vật chỉ có thể sống được trong một ranh giới xác định của các
điều kiện sinh thái như: nóng, khô hạn, phèn, mặn,... Ngoài giới hạn này, các
yếu tố đó trở thành bất lợi (stress) cho thực vật. Tùy theo giống loài, mà mức
độ biểu hiện khác nhau: một số bị chết, một số bị thương, nhưng cũng có một
số không bị ảnh hưởng. Khả năng của thực vật ngăn ngừa tổn thương khi bị
tác động bất lợi của ngoại cảnh gọi là tính chống chịu. Trên thế giới với sự
phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng của khoa học - kĩ thuật đã có nhiều công
trình nghiên cứu về tính chống chịu của cây trồng như: Bates (1996) [21],
Bamet N. M, Naylor A.W (1996) [22], Thomashow MI (1998) [35], Xiao B.,
Yhuang, NTang (2007) [37], Volcova A.M (1984) [19],… nghiên cứu về tính
chịu mặn, chịu hạn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì và thực vật khác.
Khả năng thích nghi của cơ thể thực vật đối với tác nhân biến đổi của
môi trường là rất đa dạng. Bằng cách biến đổi hình thái giải phẫu hoặc trao đổi
chất,… thực vật có thể tránh được tác động của các tác nhân bất lợi. Trong đó
kiểu thích nghi có ý nghĩa quan trọng là dựa trên khả năng của tế bào biến đổi
tốc độ và chiều hướng trao đổi chất phù hợp với điều kiện bất lợi đảm bảo cung
cấp đủ các sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống. Đặc biệt, các chất trung gian
trong quá trình trao đổi chất có vai trò rất lớn đối với tính chống chịu của thực
vật. Đã có nhiều công trình nghiên cứu ở nước ngoài trên các đối tượng cây
trồng và thực vật khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyên hóa các
hợp chất trung gian như prolin, đường khử, glyxin betain,…đối với tính chịu
hạn, chịu mặn,…của thực vật như: Kishor P.B Hong. Z., Miao G., Hu C.,

giảm khi hạt nảy mầm. HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosacarit
chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng.

7


1.2.2. Ở Việt Nam
Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng có ở Việt Nam được tiến hành
sâu rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, thuốc lá,… [1], [4], [11], [15],…
Nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở cây
lúa (Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị
Muội, Lê Trần Bình) [3], nghiên cứu di truyền gen kháng mặn lên quần thể
cây trồng của cây lúa (Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu) [8], nghiên cứu hàm
lượng protein, lipit và thành phần axit amin của một số hạt đậu tương chịu hạn,
chịu nóng (Trần Thị Phương Liên, Ngô Thu Huyền, Nguyễn Huy Hoàng, Nông
Văn Hải) [9], nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trong điều kiện
gây hạn (Nguyễn Văn Mã) [11], sự biến đổi của hoạt độ enzyme protein,
amilaza và hàm lượng prolin của đậu tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa
(Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã) [18],… Ngoài ra còn tiến hành
các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường bên ngoài đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng như nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện
thiếu nước lên một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của đậu tương trong thời kì ra
hoa (Đinh Thị Vĩnh Hà, Nguyễn Văn Mã, Lê Thị Phương Hoa) [5], ảnh hưởng
áp suất thẩm thấu môi trường đến một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa giai đoạn nảy
mầm của hạt đậu tương (Glycine max) (Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Lan
Phượng) [14], sự biến đổi hàm lượng amino axit prolin ở rễ và lá đậu xanh
dưới tác dụng của stress muối NaCl ( Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh
Huyền) [6]... Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn
tạo được nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp
với điều kiện khí hậu và canh tác ở Việt Nam.

1980). Glyxin betain và prolin là hai chất tan hữu cơ có chức năng như là
những chất có hoạt tính thẩm thấu (Steward, 1979; Rhodex, Hanson, 1993)
[40].
Theo nghiên cứu của của Võ Minh Thứ, 1999 về khả năng chịu mặn của
cây lúa cho thấy những giống lúa chịu mặn khi bị xử lí NaCl hoặc KClO3 thì

9


có hiện tượng gia tăng nhiều chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh: khả năng hút nước,
hàm lượng nước hàm lượng nito, axit hữu cơ, diệp lục, hoạt tính catalase,
peroxidase, amylase.
1.3. Prolin và vai trò của prolin
Sống trong điều kiện hạn do stress muối gây ra, thực vật có khả năng
chịu hạn nhờ hai cơ chế: tránh mất nước và chịu mất nước. Cơ chế tránh mất
nước biểu hiện qua sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi
nhằm giảm sự mất nước hoặc việc tích lũy các chất hòa tan như protein, axit
amin…để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào. Cơ chế chịu mất nước thể
hiện qua việc nhanh chóng sinh tổng hợp các chất để bảo vệ, điều chỉnh áp
suất thẩm thấu trong tế bào như ABA (axit absisic), axit amin prolin …
Prolinhay α-pirolidin cacboxylic là một α-iminoaxit ưa nước có công thức
phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở
chỗ nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng
pirolidin.

Công thức cấu tạo

Cấu trúc không gian

Prolin là axit amin ưa nước trong cơ thể thực vật, được tổng hợp từ

thấu. Nhưng những sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế được bằng cách
tăng cường hàm lượng prolin ngoại bào [30].
Theo Wyn Jones (1977) những chất được coi là tác nhân cạnh tranh thẩm
thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, được xem như đóng vai trò chủ đạo
trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất thực vật, nhằm phản ứng lại áp lực

11


thẩm thấu. Khi bị tác động bởi áp suất thẩm thấu thì sự tích lũy prolin có thể
tăng từ 10 - 100 lần.
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng prolin và axit Abscicis của những đối
tượng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu Zheng Yi - Zhi và
Litian cũng khẳng định rằng: phản ứng với áp lực nước và nồng độ muối cao,
cây đậu côve tích lũy hàm lượng prolin cao, đó được xem như phản ứng thích
nghi với điều kiện khô hạn [38].
Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công nghệ
gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung vào
nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin. Các gen này mã hóa cho enzyme
P5CS và P5CR (gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được Kishor
chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng từ 8 10 lần so với cây đối chứng [27].
Trong hạt phấn có nhiều prolin (theo Britikov: lượng prolin gấp 100 lần
cơ quan khác và gấp 200 - 400 lần đầu nhụy). Sự tích lũy prolin bắt đầu sau
giảm phân ở hạt phấn. Theo quan điểm của một số nhà khoa học: prolinlàm
tăng khả năng giữ nước của cơ quan sinh sản và tăng cường hô hấp ở giai
đoạn chu trình creps (đi vào chu trình sau khi loại nhóm amin) hoặc được sử
dụng để tái tạo aminoacid khác.
Như vậy, vai trò của prolin chống chịu stress nước ở thực vật thể hiện: prolin
tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia bảo vệ màng tế bào
chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao. Sự tập trung prolin để phản

chịu lạnh ở lúa (Murata N., 1998)[29].
Glyxin betain có ở động vật, vi khuẩn, vi khuẩn lam, tảo, nấm và nhiều
loài thực vật hạt kín chịu khô hạn, chịu mặn (Rhodes và Hanson, 1993). Vai
trò sinh lí của glyxin betain trong việc giảm stress thẩm thấu (Wyn Jones,
13


1984). Glyxin betain đã được chứng minh bảo vệ enzyme và màng sinh chất (
Krall và CS, 1989), chịu nhiệt ( Jolivet et al, 1982), chịu mặn (Jolivet et al,
1983), và chịu lạnh (Zhao và CS, 1992) và cũng có thể ổn định PSII trong sự
có mặt của NaCl cao (Murata và CS, 1992; Papageorgiou vad Murata, 1995)
[40].
Như vậy, glyxin betain có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào,
tham gia bảo vệ màng tế bào, do đó làm tăng khả năng giữ nước và gia tăng
thẩm thấu nội bào. Nhờ vậy tế bào được ổn định và cấu trúc của tế bào không
bị hư hại trong điều kiện hạn, mặn, nhiệt độ thay đổi.

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Giống đậu côve hạt trắng cao sản TV01 năng suất cao do Viện Khoa học
Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp. Đậu côve hạt trắng cao sản có thời gian
sinh trưởng ngắn (50 - 60 ngày), phù hợp trồng thuần. Đây là giống thân leo
nên khi trồng cần làm giàn. Cây cao khoảng 1 - 3m, sinh trưởng vô hạn, trái
sai, màu xanh mỡ, giòn ngọt, thích nghi rộng rãi và năng suất cao.
2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu Khoa học và
Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

độ 280C có đèn cực tím để diệt khuẩn.
2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.3.1. Xác định hàm lượng prolin trong mô thực vật (theo Bates và CS) [12]
Prolin có vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu, bảo vệ trao đổi chất chống
lại điều kiện stress, điều hòa pH tế bào chất, lưu trữ cacbon và nitơ, chức năng
chống oxy hóa.
 Nguyên tắc thí nghiệm
Dựa vào phản ứng giữa prolin và dung dịch ninhydrin trong axit tạo hợp
chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng 520nm. Công thức tính hàm
lượng prolin xác định trên cơ sở tham khảo Reigosa Roger M.J.
 Thiết bị và vật liệu:
- Axit sulphosalicylic 3% (w/v).
- Axit photphoric 6M.
- Axit acetic.
- Dung dịch ninhydrin trong axit (được chuẩn bằng cách ủ nóng 1,25g
ninhydrin trong 30ml axit acetic, thêm 20ml axit photphoric 6M). Lưu ý: axit
ninhydrin sẽ giữ ổn định chỉ trong 24 giờ, tại 40C.
- Toluen.
16


 Cách tiến hành:
Phương pháp định lượng prolin tự do trong các mô lá, bao gồm các bước
chính:
Mô lá tươi (0,25-0,50 g) + 5 ml axit Sulphosalicylic 3%
Nghiền (bằng nitơ lỏng)
Lọc (li tâm)
Phản ứng với ninhydrin
Dịch lọc + 2 ml axit ninhydrin + 2 ml axit
axetic