RỘ&ÁM
Y TÊơw
JÍỜ3
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
83C8 caso VŨC8

Đổ thực hiện đế tài này, tôi luôn nhận đươc sự quan tâm, hướng
dẫn tận tình của các thấy cô.
Tôi xin bàv tỏ lòng kính Lrọng và biết ơn sâu sắc tới:
- Thầy giáo-PGS* TLSKH Lẽ Thành Phưức
- Cô giáo-Ths. Hoàng
Thị Tuyết
Nhung
TRỮỠNG
THỊ
MAN
đã luôn quan tầm, hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàh thành khoá
luận này.

TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy, các cô, và các anh
VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG
chị kỹ thuật viên trong Bộ môn đã tạo điều kiện thuân lợi và giúp đỡ

tôi thựcKHÓA
hiện khoá
xin gửi
lờisĩcảm
ơn59
tới(2004-2009)

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2009

HÀ NỘI-5/2009


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ .................................................................................................1
Phẩn lĩ ĐẠI CƯƠNG VỀ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG

HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG...................................................2
1.1- Gốc tự do và các dạng hoạt dộng của chúng....................................2
1.1.1- Khái niệm......................................................................................2

1.1.2= Sự lílĩlh thầnh gốc tự do trong eơ
1.1.3- Vai irò và lấc hại cua gốc lự do.................................................6
1.2-...................................................................................................................... Hệ
thống bảo vệ chồng gốc tự do của ccr thể....................................................8
1.2.1- Các enzym nội bào....................................................................... 8
1.2.2- Các chất phi enzym phân tử nhó...................................................8
1.2.3- Các phối tử tạo phức khoá kim loại............................................10
1.3- Các nhóm chất chông gốc tự do............................................... 10
1.3.1- Nhóm chất đã biết rõ cấu tạo phân tủ cơ chế tác dụng................ .
10
1.3.2- Nhóm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu, và thực phẩm cố hoạt
tính chống oxy hoá....................................................................... 10
1.3.3- Hormon......................................................................................11
Phẩn 2: CÁC PHƯƠNG PIIẢP XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO VẢ CẮC

DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG.......................................13


2.2.4-

Đo hoạt tính enzym superoxyd dismutase (SOD)...................... .

30

32
2.2.5-

Đo cấc chất chống peroxỵd GSH và GSHPx................................

33
2.2.6-

Đo hàm lượng selen..................................................................35

2.3- Các phương pháp do hoạt tính chống oxy hoá toàn phần......... . .36
2.3.1-

Phương pháp TRAP................. . ..............................................36

2.3.2-

Phương pháp ABTS...................................................................37


CHÚ GIẢI CHÙ VIẾT TẮT
ABTS: 2,2-aáno bỉs-(3- ethylbenzothiazolm-6-sunfonic acid)
ESR: Electron Spin Resonance (Cộng hường spin electron)

đang là mổi quan tâm lớn của con người, đặc biệt là Y- Dược học hiện đại do
sự tiên quan cùa chúng đến nhiểu cơ chế bệnh lý nghiêm trọng à người.
Gốc tự do sinh ra từ quá trình chuyển hoá trong CƯ thể hoặc từ ngOíũ môi
tnrờng xâm nhập vầo cơ thể. Các gốc tự do và các dạng hoạt động của chúng
có khả năng oxy hoá cao, phát sinh những phản ứng dây chuyền làm tổn hại
đến tế bào, tổ chức, gây ra nhiều loại bệnh như: bệnh lý tim mạch, ung thư,
đái Lháo đường... và làm Lãng quấ trình lão hoá ở người. Do đó hiện nay các
gốc tự do đang được quan tâm nghiên cứu để tìm ra các chất chống gốc Lự do,
chống oxy hoá hiệu quả dùng cho phòng và diểu trị nhiều loại bệnh tật góp
phần bảo vệ sức khoe, kéo dài tuổi thọ của con người.
Để đánh giá lác động và vai trò gày lổn thương oxy hoá cùa các gốc tự do
và dạng hoạt động chúng trong các bệnh lý ở người và đánh giá hiệu quả của
các thuốc phòng và điều trị các bệnh trẽn, người ta đã dựa vào việc xác định
các gốc tự do và dạng hoạt dông của chúng, Hiện nay, nhiều trường Đại học,
Viện nghiên cứu đã triển khai ứng dụng các phương pháp nghiên cứu, xác
dinh gốc lự do Irong sinh học và dược học. Xuất phát từ những thực tế trẽn
chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Tổng quan về phương pháp xác định gốc tự
do và các dạng hoạt dộng cùa chúng” vtìri hai mục tiêu:
1. Viết được tổng quan về sự hình thành gốc tự do và các dạng hoại động
của chúng trong cơ thổ, trong tự nhỉcn.
2. Hộ thống được nguyên tắc của các phương pháp xác định gốc tự do và
các dạng hoạt dộng của chúng.

1


PHẦN I : ĐẠI CƯƠNG VỂ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT
ĐỘNG CỦA CHỦNG
1.1-GỐC tự do và các dạng hoạt động của chúng [6] [12]
1.1.1-

ĩ

ô 2+~e= '0'j

(1)

FAD; FMN là Coenzym); các enzym vân chuyển e (5 cytochrom là phức của
Fe2+, Fe3+) và catalase, peroxyda.se, glutalhĩon, vitamin c...
Sau đó, phân tử OT nhận từng electron:
gổc anion superoxyd
*0_2 + e+ 21 r = 1 í2o2

(2)

Hydroperoxyd
H2G2 + ể + H* = H20 4- :GR (3)

Gốc hydroxyl
‘OH + e + H+ = Hp

Phản ứng tổng:

(4)

02 + 4 É? + 4H' = 2H ,0 + Năng lưựng(ATP)

Do rò ri, thẩm lậu, tự huỷ giữa các gốc:
'02 + '02 + 2H* = H2OZ + *02
(5)
oxy đơn bội
02 Phan lử oxy hoá- khử mạnh, rất độc hại
'02 Phan tử năng lượng cao, nguy hiểrn
4 tiểu phân này gọi chung là các dạng oxy hoạt động đầu tiên (OXHĐ)

3


H2N^

^.COOH

H2N^ ^COOII

,l+1 oir hoặc
( POL
phát
triển
nhiều
gốc
- Xenobiotic(
dị rasinh):
Hoá
chất,
trừhoạt
sâu,đông
diệt khác)
cỏ, CC1 4 ... từ môi
lạo
ROS,
RNS,
RCS)
->
Mịetạo
+ •Ochất
Màng sinh học chủ yếu cấu tạo bởi phospholipid với các acid béo chưa no
trường
Fe2* + ô?. —* Feỉ+ + •0 2
có áiR"lực mạnh(10
vói) OXHĐ
vào
hoá tạo
H,0cơ-4thể
RHsẽ+chuyển

2+
Mgoài ra, Fe còn xúc lác phản ứng
Fenton tạo ‘OH, '02 gây nguy hại.
(ngoại
arachiđonic tạo MDA, ethan, pentan).
- Thuữ'c( Blcomycin, Artcmisinin...)
sinh):

- HợpCác.
chái tia,
Niiư:các
Ar-bức
NOn,xạR,R2NH- NO , Nitrcsamin
1.12.4Vi(7)
khuẩn,
virus,
ký sinh
vạt gốc + gốc (polymer hoá):
Phản -ứng
có thể
bị dập
tắt bằng
• Tia phóng xạ( đâm xuyên)
L*
+
L*
-»
L-L
Polymerhoá
I.Ỉ2.6- Cúc slressị quá tải về thể "Ị

* Trong hoá học: Trong các phán ứng phân huỷ, tổng hợp hoá học...thực
khai mào LOOH------------------►
các phản ứng sinh gốc.[6]
LO-tạo
+ OH*
chất là(9)
quá trình bẻ gãy các liên kết,
gốc tự đo. dể hình thành liên kết mới,
• N.
TiaGỐC
tử ngoại
alkaxyl gổc hvdroxyl
chất mói .
■'-* L*
+
-OOH
Gốc acid. béo gtíc hydrosuperoxyd

Các gốc này lại dóng vai trò R* ban đầu khơi mào lại phản ứng dây

ST - > ST*-------»ST
+ '02 u hắc tò. ung thư da
chuyên (7)
4 56


* Trong sinh học: R 'có nhiều vai trò quan trọng:
> Dị hoá, ly giải chất
> Tổng hợp chất (2 gốc dễ kếl hợp nhau như tổng hựp hormon sleroid}
thông qua R'


GSH
GSH

H
GS‘H‘HO*
GS
H20
O
H
GS-H-HO*
—*
H20
thể
được
tíchchống
tụ lại,oxh
saungoại
một bào(
thời gian
lượng
lích
tụ
lạingoại
đù đểbào,
dãn máu...:
tới dột hiến
•OCác
chất
thân

* Mn-SOD (superoxyđ dismustase chứa Mn/ ty thể) có tác dụng loại *0 2
nhưng lại sinh ra iỉ202 ;
*cr2 4 ‘Cf2 4 2H+
^gg-4 H2O2 4 302

(15)

Hydrnquínoĩi
(HvdrỡquitìOl
Quiiion Lưỡng gốc bền Semiquinon
(dãn Chat)
dạng khử)
(dạng oxy hoá)
(dản Chat)
_
Quinol *Cu-Zn-SOD (supcroxyd dismuslase chúa Cu, Zn/ bào tương) loại ‘0 2 từ

ty thể thoát ra bào tương(như phản ứng 15),
Phản E,
ứngVitamin
(16) có hằng
số vận
tốc rất lớn K = 10 9 L.mol '.s 1 do có xúc tác
Ví dụ: Vitamin
c, CoQ
J0, Flavonoid... đều có kiểu chuyển đổi
(tốc
độ phản ứng tăng lên hàng triệu lổn so với phân ứng (5)) và khỏng
QuiSOD
non và

ra các gốc tự do, Trong cơ thể có một số phối lử có khả Iiãng tạo phức với ion
kim loại này, làm mất khả năng xúc tác đó. Các chất tác dụng theo cơ chế này
là:
- Transferin ( protein vận chuyển Fe3+/ huyết tương)
- Laetoíerin ( phức Fe2V trong dịch (sữa, nước mắt, nước mũi))
- Feritin ( phức dự trữ Fc/ bào tương)
= QẽnỊteptaĩin; prQtêin shổa Ctì dpg phét ÌỂĨÍỊ e&y híầ Fê2+ -ị Fẽ3+

1.3-Các nhóm chất chống gốc tự do( chống oxy hoá) [6]
1.3.ỉ- Nhóm chãi đã hiết rõ cấu tạo phân tử cơ ché tác dạng
- Enạym: MĩiSOU, CuZnSOD, Catalase(Fe), GSHPx(Se)
- Goenxym: CoQ10
- Cơ chất: Glutathion(GSH), chất cổ -SH như L-cystin( Acctylcytcin)
- Vitaminc: E

, c, A, p - earoten

- Một số Flavonoid( =Biflavonoid)
- Nguyên tđ vi lượng: Cu, Zn, Mn, Se
- Các phối tử sinh học tạo phức làm mất vai trồ tạo R* của Fe, Cu( quá
tải và ở trạng thái tự do).
Thuốc chống oxy hoá được bào chế từ các chất trên, đưn lẻ hoặc kết hợp
2GSH
H2Ơ2 . ^ ) GSSG + 2 H202 (21)
nhiều chất trong một dạng
bào+chế
1.3.2Nhúm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu, và thực phẩm có
c) Cơ chế giải toả năng lượng:
hoạt
tính

• Nghệ
( curcumin);
Hydroxvl,
OH' tỏi (allicin);

Hypobromous aciđ, HOBr
Gâ'c,
xoài,
cà
chua,
cà
rốt
(carotenoid:
(3 - caroten,
lycopen,...)
Hydroperoxvl, HO,'
Ozone
03
Rau, quả, mầm ngũ cốc, củ (vitamin c, E, A)
Lipid peroxyl, L02’
Oxy dơn bội (0,'Ag)
Nấm men hia, cây xấu hổ, nhàu...(Se hữu cơ)
Lipid alkoxvl, LO’
Các peroxide lipid, LOOH
Sâm, nấm linh chi, sữa ang chúa( nhiều chất)
Các sàn phẩm cùa phàn ứng Maillard
Nhiều rau, quả, củ là rtguổn bổ sung dinh dưỡng chống oxy hoấ hằng ngày
CácHormon
dạng clo hoạt dộng (RCS):
1.3.3Nguyên

Nitrousyl cation, NO'

Nilroxyl
NOphức tạp, cùn
Là những hormon chống oxy hoá, nhưng
cư chê anion,
lác dụng
tetroxide, N204
nghiên cứuDinitrogen
tiếp.

Dinitrogen ĩrioxide, N0O3
Peroxynitrite, ONOO
Peroxynitrous acid, ONOOH
Nitronium(nitryl) cation, N02+
Alkyl peroxynitrites, ROONO
Nitryl( nitronium) chlorided^OoCL

12
11


PHẦN 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Gổc Tự DO VÀ CÁC
DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHƯNG

2.1-Phương pháp xác định trực tiếp
Phương pháp xác định trục tiếp được phận thành ha loại như sau:
2.1.1Phương pháp cộng hưởng spin dectrnn (ESR) và bấy spỉn
[11] [12]
Quang phố cộng hưởng spin clcctron (ESR) là kỳ thuật duy nhất xác định

chiều với từ trường ngoài. Do đó electron độc thân trong nguyên tử hydro sẽ
tiếp xúc với hai lừ trướng khác nhau. Do đó sẽ có hai sự hấp thụ náng lượng và
phổ hấp thụ đem sẽ trờ thành một dường dôi:

Thường biểu diẽn theo phổ đạo hàm bốc nhất:

14


Số đường trong phổ ESR cùa một gốc dược gọi là cấu trúc siêu Tinh vi và
cấu trúc này thường rất phức tạp khi các gốc có chứa nhiều hạl nhân. Có thể
xác định một gốc từ phổ ESR của nó bầng cách nhìn vào giá trị g, cấu trúc
siêu tinh vi và hình dạng phổ,
* Bẩy spỉn
Phương pháp ESR không dũ nhạy để xác định trực tiếp các gốc rất hoạt
đông như 'O 2, OH\ alk_oxyl(RO’j, R02* trong các cơ thể sống trừ khi ở nhiệt
độ rất thấp để giảm thiểu các phản ứng của chúng, mà độ nhạy của phương

phấp nầy ehi pliát hiện đượe m |ếe ít h9ệt động hm nto
£á£ i& aseerbỵl và
tocophcroxyl. Đổ khắc phục đidu này người ta sử dụng bẫy spin, một gốc Lự
do hoạt động được cho phản ứng với một bây (chất bẫy gốc) dể tạo ra một gốc
bẻn hưn( có thời gian sống dài hưn), gốc này sẽ đạt lới một nồng độ để có thể
xác dịnh dược bằng phương pháp ESR. Một bảy spin lý tưởng cần phản ứng
nhanh và đặc hiệu với gốc cần nghiên cứu và tạo ra sản phẩm bẽn về mặt hoá.
không bị chuyển hoá trong cơ thể sống và có một phổ ESR duy nhất. Mọt số
bầy ,spin( các phân tử bẫy) đã dược sử dụng trong các hệ sinh học: tNB, BNB,
4-POBN, DBNBS, đạc hiệt phổ biến là DVIPO(5,5-DímethVipyrroline-Noxide)và PBiN( alpha-Phenyỉ-lerl- bulyinitronc).
Ví dụ: DMPO phản ứng với cá hai gốc tự do "Cũ và OH' để tạo thành các
sản phẩm cổ phổ ESR khác nhau (Hình ). Hằng số tốc độ của các phản ứng

Ngoài phương pháp phát hiện OH’ bằng bầy spin và ESR, còn có các
phương pháp bẫy khác:
2. ỉ 2.1- Hydroxyl hoá các hợp chất thơm
Sản phẩm ban đẩu của sự tấn cồng OH’ trên các hựp chất Lhưm là các gốc
tự do và cuối cùng tạo các sản phẩm hydroxvl hoá. Phản ứng hyđroxyl hoá các
'hựp chất ihỡm dẫ đữợc sử dụng để phất hiện OH' bằng cấch do cắc sấn phẩm
hydroxyl tạo thành. Chứng có thế được đo bằng các thiết bị đo mầu, nhưng
các phản ứng tạo màu thường khồng thể phát hiộn tất cả các dạng đổng phrin
hydroxyl và do đó là phương pháp bán định lượng. Lý tưởng là nôn tách các
sản phẩm khác nhau bằng phương pháp sác ký khí(GC) hoặc phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao( HPLC) và được đo bằng detector điện hoá, quang phổ
hu^nh quang, phổ khối hoặc những phản ứng tạo màu đơn giản. Ví dụ, tách
bằng HPLC kết hợp với delector điện hoá nhạy đã đưực sử dụng dể đo các sản
phẩm tạo thành bởi sự tấn còng của OM’ trên các hợp chất thơm, là một
phương pháp nhạy dể đo OH' dược tạo thành hởi các tế bào, các bào quan.
Phải lựa chọn các hợp chất thơm phát hiện OH* phù hợp ( các ‘dctcctor’), sử
dụng phổ biến là salicylat. Sự tấn công của OH 4 trên salicylat(2h y dro

X

y be n zoat) tao ra hai sản phẩm hydroxyl hoá(2,3- và 2,5-

dihydroxybenzoat),và một lượng nhố sản phẩm decarboxyl hoá là catechol.
Kỹ thuật hydroxyl hoá phcnylalartin được dùng đổ đo sự tạo thành OH" do
thiếu máu cục bộ cơ tim- tái tưới máu trong cơ thể. Sự tấn công của OH' trên
phenylalanin tạo thành ba sản phẩm dihydroxyl hoá.
2.1.22- Phương pháp deoxyrihose
Sự tấn công của C)H’ vào phần tử dương 2-deoxyribose tạo ra rất nhiều sản
phẩm khác nhau. Một số mảnh sản phẩm khi bị đun nóng ở


giản hơn phàn ứng khử NBT
Cytochrome c-Fe(UĨ) + ’0_2 —> 02 + cytochiome oFe2+
Tưy nhiên, nhiểu chất khác cũng có thể khử cytochrome c (đặc biệt
ascơrbate và các thiol) gủy cản trử việc phái hiện ‘O 2 . Khắc phục bằng sử
dụng một ‘điện cực *0~ 2’ để đo sự khử cytochrom c. Thông thường thêm SOD
để thấy sự khử gián tiếp của ’0"2. Sự khử NBT diẽn ra phức tạp hơn, và '0“2

18


có thể được sinh ra trong quá trình khử. Do vậy việc thêm NBT vào một hệ
sinh học không tao ra *0~2 nhưng có thể khử N BT có thể tạo ra sự giầ phát
sinh *0~2.
Một số phương pháp dể phái hiện ’0~2 trong mô: ví dụ làm ngập mô với muối
tetrazolium có thể dãn tới tạo kết tủa formazan quan sát được dưới kính hiển vi
tại vị trí mô sinh ra 'O '2.
2.1.4-

Phát hiện nitric nxid (NO’) [11] [12]

Nitric oxiđ liên quan đến nhiổu quá trình sinh lý và bệnh lý, do đố có
nhiều phương pháp phát hiện nó. Các phương pháp bẳy trực tiếp, bao gổm các
phản ứng của NO* với các bảy spin, các hợp chất hem, các phức hạp kim loại
khác, hoặc ozon (phụ lục 2). Một phương pháp khác chứng tỏ có NO’ trong
một quá trình nếu quá trình đó bị ức chế bởi các chất ức chế enzym nitric
oxide synthase (NOS). Một phương pháp khác là do sản phẩm CUỐI cùng của
NO*, phổ biến nhất là đo NOj' bằng test Griess bởi thiết bị đo màu. Sự oxy hoá
NO’ trong dung dịch tạo ra sản phẩm chủ yếu NO-,’.
4NO* + 02 + 2HaO —»■ 4N 02’ + 41 r
2.1.5-

tiếp kháng lại các proteín bị nitro hoá. Mặc dù ít dùng để định lượng hơn các
phương pháp trên, phương pháp này có ưu điểm là cho phép xác định vị trí các
protein đã bị nitro hoá trong các mô.
2J.6-Phát hiện dạng cior hoá(UOC[) [11] [12]
Phương pháp taurine: dựa trên sư biến dổi laurine thanh taurme chloramĩne

Taưriii-NH? + HOƠ -4 ĩâurin-NHCl + H.,0
Taurin chluraminC gỉống HOCI) oxy hoá acid lhionitrobcnzoic có màu vàng
thành sản phẩm không màu, 5,5 -dithiobỉs(2-nitrobenzoic acìd) (DTNR, thuốc
thử Ellmun) .Quá trình clor hoá monochlodimedon thành đíchlodimeđon, với

sự mất hấp thụ à 290nm, đã được sử dụng để đo sự tạo thành HOC1 bửĩ
myeloperoxidase. Vì nói chung HOC1 phản ứng với nhiêu các phân tử sinh
học, nên nói chung các phép định lượng này khống hữu ích để đo sự tạo thành
của nổ trong cơ thổ. H0C1 clor hoá t.yrosin ở dạng tự do hoặc trong protein tạo

20


thành sàn phrim 3-elorolyrosin, sản phẩm này được coi là chất đánh dấu sinh
học cùa sự sinh ra HOC1. Tuy nhiên NQ 2C1 có Lhế clor ho á lyrosin lạo thành
các sản phẩm nitrat hoá và clor hoá, do đó hữu ích trong việc phân biệt tác
dụng của ONOO (nitro hoá), HOCl{ clor hoá) và N02Cl(cả hai loại phản ứng).
2.1.7-

Phát hiện hydrogen peroxid (HỊOỊ) L11Ị [12]

Các phuơng pháp cần phải nhậy vì tốc độ tạo thành H 20, bởi các tế bào và
các bào quan chỉ khoảng nmol/ phúi( ngoại trừ các thực bào đã hoạt hoá).
Phương pháp được sử dụng phổ biến nhát là sử đụng sự oxy hoá phụ thuộc

Phương pháp phát hiện trực tiếp

Sự phấn rã ‘Ch sinh ra hai kiểu phát xạ ánh sáng: ánh sáng yếu gọi là sự
phát xạ monomol tại bước sóng 1270nm và sự phát xạ dimol do sự va chạm
giữa hai phân tử ‘02, phát xạ ánh sổng ở 630nrn và 701nm. Sự phát xạ ở 1270
nm(hồng ngoại) thường dùng đổ nghiôn cứu tính chất hoá học của lO-, nhưng
đòi hỏi cần có Ịoạị detector đặc bịêt bời vì hầu hết các bô nhân quang không
nhạy cảm ở bước sổng này. Các buởc sóng của sự phát xạ dimol dẽ bị nhiỗu
bới các phán ứng phát quang khác. Bởi vậy chí những quan sát về sự phát xạ
ánh sáng chưa thể nói về ‘0-2 trừ khi có phổ phát xạ đặc trưng. Có nhiều phản
ứng hoá học tạo ra ánh sáng, ví dụ phản ứng pcroxyd hoá lipid, phản ứng
Fenlon và các phản ứng của một số loại protein hem VỚI H202.
2. ỉ .8.2- Phương pháp sử dụng cúc chất dọn gốc và cúc bẫy
Một số chất dọn phản ứng vối OH' v