MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................... 1
Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,
trong đó gần đây nhất là công trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba
chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn
Quốc), PXO99A (Philippin)........................................................................................9
LỜI CẢM ƠN...............................................................................................................i
....................................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH.....................................................................................................v
TÓM TẮT................................................................................................................... vi
Phần 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................................3
1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................................3
1.2. Mục đích và yêu cầu........................................................................................................5
1.2.1. Mục đích...................................................................................................................5
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................................................5

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................6
2.1. Bệnh bạc lá lúa.................................................................................................................6
2.1.1. Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lá lúa...................................................................6
2.1.2. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá............................................................................6
2.1.3. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh............................7
2.1.3.1. Quy luật phát sinh, phát triển.................................................................................7
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh.......................................7
2.1.4. Chẩn đoán bệnh bạc lá..............................................................................................8
2.1.5. Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá........................................................................8
2.2. Vi khuẩn Xoo...................................................................................................................8
2.2.1. Đặc điểm đặc trưng...................................................................................................8
2.2.2. Đặc điểm bộ genom Xoo..........................................................................................9

Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,

3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn........................................25
3.2.5. Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA xác định thành phần chủng vi khuẩn Xoo..27
3.2.6. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo................................................................................28

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................30
4.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn Xoo..................................30
4.1.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy......................................................................................30
4.1.2. Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR...................................................30
4.2. Kết quả nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn......................................32
4.3. Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp
Rep - PCR.............................................................................................................................35
4.4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo............................................................................................39
4.5. Mối quan hệ giữa sinh trưởng và tính gây bệnh của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu:.....40
4.6. Kết quả so sánh 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng các mẫu Xoo nghiên cứu............41

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................45
5.1. Kết luận..........................................................................................................................45
5.2. Đề nghị...........................................................................................................................46

2


Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) gây ra là
bệnh nhiệt đới điển hình của các vùng trồng lúa, đặc biệt ở những vùng thâm canh cao.
Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác
nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Bên
cạnh đó, các chủng vi khuẩn Xoo ngày càng phong phú và phức tạp, cả về thành phần
loài và tính độc. Để phòng trừ bệnh bạc lá người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác

kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải
xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử.
Trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu xác định thành phần các
chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự 2005 lần đầu tiên công bố đã xác định
được trình tự của genome vi khuẩn Xoo, vòng genome dài 4,9 triệu bp. Đã xác định
được những vùng gen bảo thủ đặc trưng cho vi khuẩn Xoo và vùng biến động nhiều
giữa các chủng. Đồng thời xác định được các phổ enzyme, phổ protein của vi khuẩn
Xoo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, phương pháp sử dụng chỉ thị
phân tử (DNA, Protein hay Isozyme) xác định đa dạng di truyền các chủng được áp
dụng và gặt hái nhiều thành công.
Nghiên cứu của Phan Thanh Tùng 2008 sử dụng kỹ thuật rep-PCR và IS-PCR
đã xác định đa dạng một số chủng vi khuẩn thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
năm 2007, và so sánh với các chủng do Phan Hữu Tôn và cs thu thập 2002; kết quả
cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và
đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo
đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọn
tạo giống kháng bệnh bền vững. Do đó việc thu thập mẫu bệnh mới và phân loại chúng
là công việc cần phải làm thường xuyên. Vì vậy được sự hướng dẫn của bộ môn
CNSHƯD, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas
oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử”.

4


1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các mẫu vi khuẩn Xoo, từ đó
phân chia thành các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa.
1.2.2. Yêu cầu

2.1.2. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá
Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng
nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng
này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện
tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của
sự nhiễm bệnh.
Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài theo gân
chính, có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Vết bệnh lan từ mép ngoài
vào gân lá theo đường gợn sóng. Vào lúc trời ẩm hoặc buổi sáng sớm, đầu hoặc mép lá
có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn
màu hổ phách.

6


Hình 2.1. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá lúa
2.1.3. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh
2.1.3.1. Quy luật phát sinh, phát triển
Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc. Bệnh phát
triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt khi có mưa
to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan. Vì thế vụ mùa bệnh
thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân.
Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa
vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá.
Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và
điều kiện tự nhiên của mỗi vùng.
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh
Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh.
Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc
lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá

2.2. Vi khuẩn Xoo
2.2.1. Đặc điểm đặc trưng
Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi tròn,
có một lông roi ở một đầu, kích thước 0.7-2 x 0,4-0,7 µm. Trên môi trường nhân tạo
khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp (do hình thành sắc tố
xanthomonadin), rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm. Xoo tạo
nhiều polysacharide ngoại bào EPS, có vai trò quan trọng trong việc hình thành giọt
dịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩn
phát tán nhờ gió, mưa. Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá
gelatin, không tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axít trong môi trường
có đường. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30 0C, nhiệt độ tối thiểu

8


0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết. Vi khuẩn có thể sống
trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2.

Hình 2.2. Tế bào vi khuẩn Xoo và khuẩn lạc Xoo trên môi trường nhân tạo
2.2.2. Đặc điểm bộ genom Xoo
Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,
trong đó gần đây nhất là công trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba chủng
phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc),
PXO99A (Philippin).
2.2.2.1. Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018
Cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 thể hiện bằng
tám vòng tròn. Vòng ngoài cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị
100 kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác
nhau tương ứng. Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen
chưa xác định rõ chức năng được ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí

loài vi khuẩn X. axonopodis pv. citri (Xac) và X.campestris pv. campestris (Xcc). Tuy
nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc.
Đồng thời nhóm tác giả còn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu
nhạy (hrp), những gen sinh ra vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã
màng tế bào thực vật. Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi
khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hòa thảo.

Hình 2.4. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331.
2.2.2.3. Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A
Đây là công bố mới nhất về trình tự genome của vi khuẩn Xoo được tiến hành
bởi Steven L. Salzberg và cộng sự. Bộ genom PXO99 A là bộ nhiễm sắc thể vòng đơn
gồm 5,240,075bp, dài hơn genom hai chủng trước (4,941,439bp và 4,940,217bp), hàm
lượng G + C chiếm 63.6%, chứa 5083 gen mã hóa protein, trong đó 87 gen không có ở
KACC10331 hay MAFF311018, có 2 operon RNA ribosome, 55 tRNA. PXO99 A gồm
có một số lượng lớn tính độc liên quan đến hoạt động phiên mã - các gen giống như
effector và có ít nhất 10 vùng NST được sắp xếp lại so với genome của hai chủng
KACC10331 và MAFF311018, trong đó có 7 trong 10 vùng là do có sự gắn thêm vào

11


của các trình tự chèn. PXO99A gồm nhiều bản copy của các trình tự chèn khác nhau.
Một vùng CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats) mở ra
nhanh chóng ngăn cản sự nhiễm thực khuẩn thể đối với chủng PXO99A.

Hình 2.5. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng PXO99A.
2.2.3. Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related
genes)
- Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity):
Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa cho hệ

hộp PIP hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh có trình tự: TTCGN…N15…TTCGN, nằm ở

13


vùng điều khiển của gen. Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số
còn lại nằm rải rác ở vùng khác trong genom.
Bảng 2.1. Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo

14


- Nhóm gen avr (avirulence)
Protein không gây độc thuộc hệ thống tiết loại III, chúng kích thích khả năng
kháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng bởi vậy chức năng của nó được
xác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng gây bệnh. Chủng MAFF311018
biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa rất cao. Nó chứa một số các gen không
gây độc. Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong họ gen không độc
avrBs3/pth. Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 – 23 các
chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập
nhân (NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (AD). Cấu trúc này chứng tỏ các protein
này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ.
Trong genom vi khuẩn Xoo, nhóm tác giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ
tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 2.2. Bảng liệt kê 17 bản copy các thành viên trong họ gen avrBs3/pth

15


Mặc dù chúng có trình tự khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệt

- Nhóm 2: là các yếu tố lặp lại hình thành do sự chập lại của hai trình tự lặp kích thước
124 – 127bp (ERIC: enterobachterial repetitive intergensis conversus) (Hulton CS, Higgins

CF, Sharp PM, 1991) hay là đơn vị gen lặp lại (Shaples và Llyod, 1990).
- Nhóm 3: là các trình tự hộp BOX, kích thước khoảng 154bp (Versalovic, 1994).

Đây chính là cơ sở cho phương pháp dùng chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp
lại để tiến hành phản ứng PCR, nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá,
gọi chung là phương pháp Rep-PCR.
2.3. Đa dạng các chủng Xoo
2.3.1. Định nghĩa đa dạng di truyền
Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" (biodiversity,
biological diversity) có nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi,
bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thuỷ vực khác,
cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; thuật ngữ này bao
hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái (Norse and
McManus, 1980). Ngoài ra còn nhiều định nghĩa về đa dạng di truyền khác.
2.3.2. Thành phần chủng Xoo
Thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn bạc lá là rất khác nhau, thêm
vào đó là sự biến đổi thường xuyên, phát sinh thêm nhiều chủng vi khuẩn mới, là
thách thức không nhỏ đối với công tác quản lý và phòng trừ bệnh bạc lá lúa trên toàn
thế giới. Công tác điều tra, xác định thành phần chủng là khâu quan trọng.
2.3.2.1. Trên thế giới

17


Nghiên cứu của Devadath, 1985 đã thống nhất phân chia vi khuẩn bạc lá
lúa thành 3 nhóm chính, ký hiệu là I, II, III. Từ đó làm tiền đề cho nhiều nghiên
cứu về sau.

chủng 3 ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Song những chủng còn lại vẫn có tiềm năng
gây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây
bệnh với các giống lúa. Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước
ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính
xác các chủng vi khuẩn Xoo đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu,
và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững.
2.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo
2.3.3.1. Các loại chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
RFLP: Sự sai khác về kích thước các đoạn cắt thu được khi cắt bằng enzyme
giới hạn gọi là sự đa hình về chiều dài của các đoạn cắt giới hạn (Retriction Fragment
Lenght Polymorphism – RFLP). Các đoạn cắt ra bởi cùng một loại enzyme giới hạn
với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền
để phân biệt các chủng, loài khác nhau.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – Đa hình các đoạn DNA nhân
bản ngẫu nhiên. Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn DNA
bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt
cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở vị trí bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự
bổ sung với nó.
Ngoài ra còn một số chỉ thị khác để nghiên cứu đa dạng nhưng ít sử dụng hơn.
2.3.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo trên thế giới
Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D. Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đã
thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ. Sử dụng phương
pháp RFLP với hai mẫu dò (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vào
trình tự gen avrXa10 và Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS 1112.
Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác
phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI. Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác

19



A. Onasanya và cộng sự 2008, sử dụng các mẫu isozyme khác nhau để kiểm tra
mức đa hình enzyme và đa dạng di truyền của 30 isolate Xoo phân lập ở Tây Phi.
Nghiên cứu đã phát hiện 23 locut isozyme, trong đó SKDH cho đa hình từ 33,3 –
93,3%, EST and G6PH cùng cho đa hình 40 – 96,7% trong các mẫu Xoo phân lập. 23
loci isozyme này được sử dụng để xây dựng cây phả hệ giữa 30 mẫu Xoo, kết quả chia
thành 2 nhóm di truyền chính (Xoo-A and Xoo-B), mỗi nhóm chính chia thành 2 nhóm
nhỏ (Xoo – A1 và Xoo - A2) và (Xoo – B1 và Xoo - B2).
2.3.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo tại miền Bắc Việt Nam

20


Những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho đến nay
vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa đẳng đơn
gen (gen kháng bệnh bạc lá). Từ đó thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào
đây, các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những
nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen.
Năm 2008, Phan Thanh Tùng đã ứng dụng những nghiên cứu của các tác giả
Adhikari, 1999 và Vera Cruz, 1996 đề xuất. Sử dụng phương pháp nghiên cứu đa dạng
di truyền bằng Rep-PCR và IS-PCR, xử lí bằng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích
đa hình DNA xác định được 13 chủng vi khuẩn tại hệ số tương đồng di truyền 0,95.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng 3 mẫu vi khuẩn Xoo0 (R7, R10, R14) do Phan Hữu Tôn và cộng sự
phân lập năm 2002 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và các isolate mới phân lập
vụ mùa năm 2009 (Bảng 3.1). Các mẫu vi khuẩn này được bảo quản trong môi trường
Skim – Milk (Skim Milk 10g, L-glutamic 1.5g, nước cất 100ml) ở -80 0C tại phòng thí
nghiệm Bộ môn CNSHƯD – Khoa CNSH.
Dùng 10 dòng đẳng đơn gen IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7,
IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 và 16 dòng đa gen IRBB1/4, IRBB1/5, IRBB1/7,

HAU 020361
HAU 020083
HAU 020131

Tên giống
Nếp thơm
Hybrid rice
Khang dân
TN 13-4
Nếp tân
Nhị ưu 838
Khang dân

21

Địa điểm thu thập
Bình Giang, Hải Dương
Yên Bình, Yên Bái
Tiên Du, Bắc Ninh
Hà Nội
Thuận Châu, Sơn La
Quỳnh Lưu, Nghệ An
Diễn Châu, Nghệ An


8
9
10
11
12


Nhị ưu 383
Q5
Nhị ưu 838
Bắc thơm 7
Q5
HT1
Hương cốm
Khang dân
Bắc thơm
Thục Hưng
Nàng hương

Yên Bình, Yên Bái
Bình Giang, Hải Dương
Quỳnh Lưu, Nghệ An
Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội
Quốc Tuấn, Nam Sách, Hải Dương
Nam Sách, Hải Dương
Đông Quan, Đông Hưng, Thái Bình
Sóc Sơn, Hà Nội
Nam Sách, Hải Dương
Hưng Hà, Thái Bình
Hưng Hà, Thái Bình

3.2. Phương pháp nghiên cứu
Phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn
Xoo

So sánh khả

NaHPO4.12H2O
Ca(NO3)2.4H2O
Peptone

:
:
:
:

300g
2g
0,5g
5g

Đường Saccarose
Agar
Nước cất
pH

22

:
:
:
:

15g
15g
1000ml
7,0


23


- Đặt vào máy gia nhiệt ở 56oC trong 15 phút để proteinase K phân giải màng tế
bào vi khuẩn.
- Nâng đột ngột lên nhiệt độ 80oC trong 15 phút để làm bất hoạt enzyme
proteinase K.
- Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút phần dịch trong phía trên chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4oC.

24


* Kiểm tra sản phẩm chiết tách:
Điện di 5 µl DNA vi khuẩn (lấy 5 µl DNA trộn với 2 µl Loadingdye) trên gel
agarose 1%, hiệu điện thế 70 V trong 60 phút, sau đó nhuộm bản gel điện di với
ethydium bromide trong 10 phút, quan sát dưới đèn UV, mẫu chiết tách thành công sẽ
hiện một vệt sáng rõ nét trên gel.
* Thực hiện phản ứng PCR
Các mẫu DNA chiết tách thành công sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng
PCR. Sử dụng cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae, đó là
XOR – R2 và XOR – F (Odachi,1990):
Tên mồi
XOR – R2
XOR - F
Thành phần phản ứng:

Trình tự mồi
5’ – CTCGGAGCTATATGCCGTGC - 3’